Nghiên cứu kĩ thuật vi ghép cây bưởi (Citrus grandis)

biotechvn
Số bài viết:
447
Số tài liệu đã gửi:
288
Ngày đăng:
22-06-2012
Ngày cập nhật:
27-11-2012 | 06:13:02
Thể loại:
Luận văn - Luận án
Chuyên ngành:
Công nghệ tế bào
Số lần xem:
5 239
Số bình luận:
0
Ngôn ngữ tập tin:
Tiếng Việt
Bạn phải Đăng nhập để tải tập tin
Hình thức chia sẻ: 
Đường dẫn
Mô tả tài liệu: 
Bưởi là cây đặc sản quý, có giá trị dinh dưỡng cao, ngoài chất đường (8 – 10%,
trong đó saccharose là chủ yếu), bưởi đặc biệt rất giàu vitamine C (khoảng 40
mg/100g thịt quả), acid hữu cơ (0,2 – 1,0%), pectin (0,45 – 0,5%) có tác dụng tốt đối
với sức khoẻ. Pectin của bưởi có tác dụng chống nhiễm kim loại nặng và nhiễm phóng
xạ, tham gia vào quá trình bài tiết cholesterol, chống xơ cứng động mạch và có tác
dụng chữa bệnh đường ruột [4].
  Theo Đường Hồng Dật (2000), ở Trung Quốc các thầy thuốc đã dùng vỏ quả
cam quýt để phòng ngừa dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da.
  Bưởi còn là loại quả có tiềm năng kinh tế cao, trọng lượng quả lớn, cây có thể
cho thu hoạch quả đạt năng suất cao.
  Theo Nguyễn Văn Kế (1990), sản lượng bưởi  toàn cầu khoảng 5 triệu tấn trên
tổng số 65 triệu tấn quả của họ cam quýt. Riêng tại Việt Nam, Nam Bộ có khoảng
2000 hecta trồng cây họ có múi.
  Theo FAO (Tổ chức an toàn lương thực thế giới, 2002) thì diện tích trồng cam
quýt và bưởi trên toàn thế giới khoảng 7.330.000 ha với sản lượng 103.300.000
tấn/năm, mang lại giá trị khoảng 3 tỷ USD. Và cũng theo dự báo của FAO trong thời
kỳ 2001 đến 2010, nhu cầu tiêu thụ cây cam quýt tăng cao hơn tốc độ tăng sản lượng,
theo đó nhu cầu thị trường tiêu thụ tăng bình quân 3,6%/năm. Trong khi sản lượng chỉ
đạt 2,8%/năm (Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam, 2001).
  Ngoài ăn tươi, quả bưởi còn có thể chế biến thành nhiều sản phẩm có giá trị
kinh tế như các loại nước giải khát, lấy tinh dầu từ vỏ và hạt.
....
3.1.3.2 Các giống bưởi dùng làm gốc ghép
  (a) Bưởi Xim Vang: Phân cành thấp, kích thước lá dài trung bình 3,0 cm chiều
rộng 2.5 cm. Đây là giống có kích thước quả khá cao so với các giống khác cao 24,5
cm. Hàm lượng vitamin C đứng hàng thứ 3, sau bưởi Đường Hồng và bưởi Đường Da
Láng 37,8%, trọng lượng quả 1,999g. Hiện nay, bưởi Xim Vang  được trồng nhiều ở
Đồng Nai (Nguyễn Văn Kế, 1995).
  (b) Bưởi Bồng: Là giống bưởi ở Huế, theo những nghiên cứu khác nhau thì đây
là giống bưởi lai, có hệ gen gần với chanh và quýt hơn là bưởi. Do có khả năng chống
chịu với điều kiện khắc nghiệt của  thời  tiết cũng như khả năng chịu ngập đứng hàng
thứ ba sau bưởi Ổi và bưởi Hồng Đường, khả năng chịu mặn đứng hàng thứ nhất trong
41 giống bưởi ở Việt Nam nên giống bưởi này dùng làm gốc ghép. 
2.2 Các loại bệnh virus và môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt
  2.2.1 Các loại bệnh do virus
Loài virus citrus là loài rất nhỏ,  chỉ có thể nhân lên trong tế bào sống, thường là tế bào của
citrus nhưng nó cũng có thể nhân trong cơ  thể của aphid hoặc một vài loài
làm vector  khác. Bệnh virus thì không chữa được, khi một cây nhiễm thì nó có thể tái nhiễm
đến khi chết. Khi cây nhiễm, nó có thể là tác nhân nhiễm cho các cây khác. Bệnh virus
thường không lây qua hạt. Một vài loài virus chỉ nhiễm trên một vài loài citrus. Virus
có thể nhiễm vài tháng hoặc vài năm trước khi có một vài triệu chứng. Trong một vài
trường hợp, triệu chứng có thể nhanh chóng được phát hiện [27].
    2.2.1.1 Citrus Tristeza virus (CTV)
Virus gây bệnh này có nguồn gốc từ nhiều năm trước ở Trung Quốc. Tristeza là
bệnh tàn phá rất lớn trên citrus ở Bắc và Nam Mỹ, mặc dù có khoảng phân bố rất rộng  trên thế giới.
Bệnh  hiện  không còn ở Argentina,  Brazil và Uruguay, đây  cũng  là bệnh nguy hiểm ở Nhật
Bản. Bệnh cũng được xác định là có hiện diện ở nước ta [27].
  Bệnh do virus dạng sợi dài (2 x 10  –  11nm), tập trung và làm hỏng mạch
dẫn nhựa libe trong  cây, xuống rễ  và làm suy dinh dưỡng như
rụng lá, chết đọt, lùn cây và thường thối rễ. Bệnh có thể lộ ra ở cây con mới trồng hay ở cây lớn bị 
suy dinh dưỡng. Cây có mang mầm bệnh có thể vẫn thấy khỏe mạnh trong liếp ươm
nhưng sớm lộ triệu chứng ngay sau khi trồng. Cây mang bệnh mãn tính sẽ bị lùn, phù
gốc do mắt tháp phát triển quá khổ. Hầu hết các giống cam quýt đều có triệu chứng
sọc lõm ở gỗ thân và cành (stem pitting). Một dạng đặc trưng của bệnh là triệu chứng
tổ ong khi dùng cam chua làm gốc ghép: khi tách vỏ ở vùng bên dưới mắt tháp sẽ thấy
nhiều lỗ nhỏ xếp cụm trong gỗ [27].
  Bệnh được truyền bởi một loài aphid có tên là  Toxoptera citricida Kirkaldy.
Người ta kiểm tra thấy rằng nếu 5 aphid tấn công cây thì 50% cây sẽ bị nhiễm và nếu
15 aphid tấn công  cây thì 70% sẽ bị nhiễm. Người ta cũng nhận thấy rằng các type
khác nhau của virus này đều gây bệnh được [27].
  CTV nhiễm trên tất cả các loài (nhân giống và tháp ghép) của cây citrus. Nó
được tìm thấy trên toàn thế giới và có nhiều giống khác nhau, trong các type khác nhau
đó có các type tàn phá rất lớn. Bệnh chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường, các
dạng khác nhau của cây citrus và các nòi virus khác nhau. Khi cây được ghép trên gốc
kháng thì cây có khả năng phục hồi lại sau đó [27].   
    2.2.1.2  Citrus tatter leaf virus ( CTLV) CTLV được phát hiện đầu tiên 1962,
trên cây chanh Mayer thuộc Trung Quốc. Sau đó một vài loài virus cũng được phát
hiện trên giống chanh đó ở Australia và ở phía Nam châu Phi [27].
  Bệnh do virus dạng sợi tóc và truyền bệnh bằng côn trùng hoặc các vector khác.
Con đường chủ yếu là lây qua nhân giống và tồn tại ở chồi. Loại virus này được
truyền qua nhựa cây, có thể truyền khi cắt cành và công cụ làm vườn khi cắt cây bệnh
trước [7].
  Hầu hết các loài citrus khi nhân từ giống có chứa loài virus này không thấy
triệu chứng. Tuy nhiên, cây nhiễm đều bị lùn, chậm tăng trưởng, lá biến dạng và nổi u
(sưng tấy), cành non thì ngoằn ngèo. Ảnh hưởng rõ ràng nhất là chồi vàng (khi chồi
non ghép trên gốc ghép) [27].
    2.2.1.3 Citrus exocortis virus (CEV)
  CEV được phát hiện đầu tiên năm 1948, ở Australia và bây giờ nó có ở khắp nơi trên thế giới.
Bệnh làm chậm tăng trưởng trên cam. Bệnh rất dễ lây qua ghép, ở các chồi ghép và không thấy triệu
chứng khi nhân giống. Thể viroid truyền qua cơ giới công cụ cắt và tỉa cành [27].
  Mầm bệnh do một loài viroid của virus, viroid làm chết vỏ, khô, vỡ  ra và có thể bóc vỏ
được dễ dàng. Nhựa thì không có dưới lớp vỏ của cây như  vậy. Bệnh có thể nhiễm ở hầu hết loài
citrus khi nhân giống và luôn tiềm ẩn trong cây [27].
  2.2.2 Môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt
  Đối với cây thuộc họ cam quýt thì nguyên nhân truyền bệnh do công cụ làm cắt
tỉa cành trong vườn, do các loại côn trùng truyền bệnh mà trong đó rệp là tác nhân chủ
yếu. Rệp  sống  chủ  yếu bằng  cách hút nhựa và  chất kích  thích  sinh trưởng ở  các bộ
phận non của cây do đó thường làm cho cây giảm quang hợp, nếu tấn công trên trái thì
làm trái nhỏ sẽ bị rụng, bị đen, kích thước trái nhỏ, dị dạng, giảm chất lượng quả từ đó
làm giãm giá trị thương mại. Đồng thời, rệp còn là tác nhân truyền bệnh virus gây hại
rất  lớn  cho các  cây thuộc  họ  cam quýt  nói  riêng và  nhiều  loại  cây trồng  khác  nói
chung. Phân của  các  loài  rệp  này  thải  ra quyến  rũ  nấm  bồ  hống  đến  cộng  sinh làm
giảm khả năng quang hợp của cây, do phân của chúng chứa một lượng đường rất cao.
Đồng thời phân của chúng còn có thể hấp dẫn các loài kiến khác nhau đến tha chúng đi
nơi khác để tiếp tục gây hại cho cây trồng [3, 7].
  Rệp hại cây trồng được phân ra làm hai nhóm chủ yếu  là nhóm  rệp muội hay
còn gọi là rầy mềm, nhóm thứ hai là nhóm rệp sáp.
    2.2.2.1 Rệp muội hại cây trồng
  Nhóm rệp này chỉ có một họ duy nhất là Aphididae thuộc bộ cánh đều, có thân
mềm, dài từ 1 – 2 mm, dạng hình quả lê, trần trụi, cuối bụng có phiến đuôi và hai ống
bụng hai bên.
2.3 Các cách nhân giống của cây bưởi
  Để nhân giống các cây cam quýt nói chung và cây bưởi nói riêng ta có thể sử
dụng các cách nhân giống khác nhau như gieo hạt, chiết cành, giâm cành, ghép.
  2.3.1 Nhân giống cổ điển
    2.3.1.1 Nhân giống bằng hạt
  Đây là cách nhân giống được bắt đầu khi loài người biết trồng cây ăn quả. Đây
là quá trình tạo cây con từ hạt, hạt được hình
thành do sự thụ tinh của tế bào hạt phấn và tế
bào noãn, cây mới mọc mang đặc tính của cả bố
và mẹ hoặc nghiêng hẳn về bố hoặc mẹ. Cách
nhân giống này áp dụng chủ yếu để lấy cây con
làm gốc ghép. Rất ít vùng dùng cây con làm
giống vì phải 8  –  10 năm mới có thể cho quả
được [6 – 12].
  Các yêu cầu khi chọn hạt làm gốc ghép để nhân giống:
  Chọn những hạt mẩy không sâu bệnh từ quả tốt để làm giống.  
  Chọn cây thích hợp với điều kiện tự nhiên của địa phương có năng suất cao,
phẩm chất tốt.
  Chọn cây là những cây ổn định về mặt sinh trưởng, có từ 6 – 7 năm tuổi trở lên.
  Chọn cây sinh trưởng khỏe, có bộ rễ phát triển mạnh, cành phân tán cân đối, lá
tươi tốt, không sâu bệnh.
    2.3.1.2 Nhân giống bằng cách chiết cành 
    2.3.1.3 Nhân giống bằng cách giâm cành
  Phương pháp này dựa trên khả năng hình thành rễ phụ (rễ bất định) của các
đoạn cành đã cắt rời khỏi thân mẹ (hoặc các đoạn rễ). Ngày nay, phương pháp này
được ứng dụng rộng rãi nhằm nhân giống các cây công nghiệp, cây lâm nghiệp. Ở
nước ta, việc nhân giống chanh bằng phương pháp giâm cành rất phổ biến nhằm tạo
cây lùn, nhanh thu hoạch quả và chu trình kinh doanh khai thác ngắn nhưng hiệu quả
cao [15].
  Nhà giâm cành nói chung phải thoáng mát, kín gió, trao đổi không khí tốt. Cành
để thực hiện nhân giống là những cành bánh tẻ, phần lớn là những cành ra trong năm,
có khi ra cùng trong vụ xuân hoặc hè. Nguyên tắc chung là chọn những cành lưng
chừng tán, ngoài bìa tán và những cành ở cấp cành cao (những cành không mang hoa,
quả và những cành ổn định sinh trưởng chưa lâu).
  Cắt cành giống vào thời gian không có nắng trong ngày: sáng sớm hay chiều tối
vì cành lá sẽ mất nước đột ngột, tỉ lệ ra rễ kém.
  Cành cắt xong cần được phun nước cho ướt lá rồi dựng đứng vào trong xô hoặc
thùng có chứa nước sạch, đậy lại bằng vải màu tối đã thấm ướt. 
  Cành sau đó được xử lý lại, đối với cành dễ ra rễ có thể cắm thẳng vào nền
giâm, hoặc xử lý hóa chất ra rễ ở nồng độ thấp (NAA, IAA hay IBA).
  Phải thường xuyên duy trì độ ẩm từ lúc cắm cành cho đến lúc ra rễ.
  Nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo rễ ở cây ăn quả là 21 – 26oC.
  Khi rễ của cành giâm mọc đủ dài, hơi chuyển từ màu trắng sang màu vàng và
dẻo thì phải ra ngôi kịp thời trong vườn ươm hay túi polymer.
    2.2.1.4 Nhân giống bằng cách ghép
.........
  ưu điểm nhất của phương pháp này là thao tác đơn giản, không cần bóc vỏ
cành ghép  và gốc ghép, nhưng nếu cây chuyển nhựa tốt thì tỷ lệ sống cao hơn.
  Dùng dao cắt hai lát trên gốc ghép lấy đi một mảnh cả gỗ và vỏ thêm hai lát ở
cành ghép để lấy mắt có cả cuống lá, lắp vừa khít vào gốc ghép, buộc chặt bằng dây.
Sau một thời gian nhất định ta có thể mở dây ra và cắt ngọn gốc ghép [12, 15].
  2.3.2 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô
  Trong trường hợp cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí hàng đầu
trong nhân giống vì kết hợp được khả năng chống chịu của gốc hoang dã với mắt ghép
có ưu điểm năng suất và phẩm chất tốt. Tuy nhiên trong lúc ghép theo kỹ thuật truyền
thống, do thời gian trồng gốc ghép kéo dài và kích thước mắt ghép khá lớn nên bệnh
virus có thể truyền lây.  
  Để khắc phục nhược điểm trên, kỹ thuật ghép đỉnh sinh trưởng gọi tắt là vi ghép
được thử nghiệm và mang lại kết quả tốt. Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng nhưng qua dinh dưỡng của gốc ghép. Đỉnh sinh trưởng làm mắt ghép có kích
thước từ 0,2  –  0,5 mm, được tách từ búp non đang sinh trưởng mạnh của cây mẹ
trưởng thành, gốc ghép là cây mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại, toàn bộ cây
ghép được nuôi dưỡng trong điều kiện ống nghiệm vô trùng. Những cây ghép thu được 
bằng phương pháp này hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ
cho mắt ghép [14].
    2.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến vi ghép
  Chất điều hòa sinh trưởng
  Sẽ có lợi hơn nếu các chồi ghép được đặt nuôi cấy trong môi trường MS có
chứa chất điều hòa sinh trưởng. Jonal và ctv  (1983) đã chứng minh, thêm Cytokinin
vào môi trường nuôi cấy (0,1 mg Zeatin/l nếu  chồi nuôi cấy trong 48 giờ; 0,01 mg
Zeatin/l nếu nuôi thêm 48 – 240 giờ) có hiệu quả đặc biệt kích thích sự tiếp hợp nhanh
chóng của gốc ghép và chồi ghép. Để mỗi lần ghép thành công, có một cách là nuôi
chồi ghép trong môi trường nuôi cấy có chất điều hòa sinh trưởng trong một thời gian
ngắn trước khi ghép 5 – 10 phút  trong môi trường 10 mg/l 2,4 D hoặc 1 mg/l BAP  
làm tăng tỷ lệ thành công đối với cây có múi (Edriss và Burger, 1984). Starratino và
Caruso (1998), đạt tỷ lệ cây ghép sống khá cao khi nhúng  chồi ghép và mặt cắt gốc
ghép vào môi trường có 0,5 mg/l BAP trong 20 phút trước khi cả hai ghép lại với
nhau.
  Sự hóa nâu và khô dần của chồi ghép.
  Chồi khô dần là nguyên nhân dẫn đến sự thất bại của kỹ thuật. Để ngăn cản quá
trình này, Piego Alfaro và Murashige (1987) đã dùng lớp vỏ mỏng môi trường dinh
dưỡng có agar để liên kết nơi ghép. Agar sẽ làm tăng sự phát triển của chồi và chất
dinh dưỡng từ khối agar được tiết ra nuôi chồi trong suốt tuần thứ nhất đến tuần thứ ba
sau khi ghép; nếu không sẽ có kết quả là cây ghép rất yếu.
  Chồi bị hóa nâu nguyên nhân do các chồi ghép quá nhỏ hay thao tác quá chậm,
có thể hạn chế bằng cách ngâm chồi trong dung dịch chống oxy hóa 2g/l Sodium
Diethyldithiocarabamate (DIECA) hoặc nhỏ một giọt dung dịch lên trên mặt cắt của
gốc ghép ngay trước khi ghép chồi lên. Theo Navarro (1988) thì thao tác nhanh kỹ
thuật ghép nhanh sẽ ngăn cản quá trình oxy hóa phenol và có hiệu quả hơn những chất
chống oxy hóa.
  Với 0,5 mg/l NAA đã làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của tổ hợp ghép (37,5%) cao
hơn rất nhiều so với môi trường không có NAA (10,43%)
Hơn nữa khi có NAA thì không cần thường xuyên khử chồi phụ so với khi không có
NAA phải khử chồi phụ mỗi tuần hoặc 15 ngày một lần vì NAA ức chế sự hình thành  
và phát triển của các chồi phụ nhưng kích thích gốc ghép mọc nhiều rễ phụ và phát
triển rất tốt.
  Khi kết hợp NAA và Kinetin với nồng độ trên, chồi ghép mau liền sẹo và phát
triển tốt, sau 3 tuần kích thước chồi đạt 8 mm. Tuy nhiên gốc có hiện tượng hình thành
mô sẹo và không hình thành rễ cho dù ta cấy chuyền sang môi trường không có chất
điều hoà sinh trưởng sau 2 tuần. Với 3 mg/l Adenin cây ghép có tác dụng ngược lại.
Hiện tượng mắt ghép bị nâu đen hay bị khô đều thấy ở tất cả độ tuổi gốc ghép
  Tuổi của gốc ghép
  Thí nghiệm với gốc ghép ở độ tuổi khác nhau 15, 21, và 60 ngày cho thấy gốc
già, cứng nên khó cắt và dễ bị dập nơi vết cắt nhưng ngược lại do vỏ dầy cứng nên giữ
được mắt ghép khi ta đặt vào, mắt ghép ít bị rơi khỏi nơi ghép và dễ liền sẹo sau khi
ghép. Tuy nhiên chú ý phải nhẹ nhàng khi đặt mắt ghép vào tránh kẹp chặt làm tổn
thương cành ghép. Tuổi gốc ghép còn nhỏ thì nơi ghép dễ bị mô sẹo hoá và tốt nhất là
gốc ghép ở độ tuổi 15 ngày sau nảy mầm.
  Các tác giả đã chứng minh rằng:
  Gốc ghép non, mắt ghép dễ bị mô sẹo hóa, khả năng nảy chồi thấp.
  Gốc già, mắt ghép khó liền, tỷ lệ mắt ghép nâu đen cao.
  Thích hợp nhất là từ 14 – 16 ngày tuổi của gốc ghép sau khi hạt nảy mầm. Kết
quả cụ thể tính theo % ghép thành công là: 15,2; 16,6; 40,0; 37,1; 36,6; và 14,3% với
tuổi gốc ghép tương ứng là 10; 12; 14; 16; 18 và 20 ngày (17).
  Độ lớn của mắt ghép
  Chồi ghép có thể lấy trực tiếp hoặc nuôi cấy một thời gian ngắn trước khi ghép.
Tỷ lệ ghép thành công sẽ cao hơn khi nuôi lớn những đỉnh sinh trưởng độc lập cho đến
khi chúng có kích thước lớn hơn trước khi chúng được ghép (17, 1).
  Khi thử với gốc  ghép có độ tuổi thích hợp là 14 ngày, mắt ghép gồm 3 kích
thước tương ứng với tỷ lệ thành công:
  0,10 – 0,15 mm (2 mầm lá): 20%
  0,20 – 0,30 mm (4 mầm lá): 30%
  0,40 – 0,60 mm (6 mầm lá): 55%
  Như vậy, ghép mắt lớn dễ thành công nhưng để đảm bảo tính sạch bệnh virus
không nên dùng mắt ghép lớn hơn 0.5 mm.
  Khử chồi phụ
  Trong nách lá mầm của gốc ghép có mắt ngủ, bình thường thì bị ưu thế ngọn ức
chế. Khi ghép, chồi ngọn bị khử nên chúng phát sinh rất nhanh, gây ức chế phát triển
của mắt ghép. Để tránh tình trạng này cần khử mắt chồi ngủ bằng cách khoét vào thân
khi cắt bỏ hai lá mầm để loại chồi ngủ.
  Chồi ngủ cũng có thể phát sinh từ tượng tầng  của mặt cắt trên gốc ghép, cần
phải loại bỏ chúng ngay khi phát hiện để tạo điều kiện cho chồi ghép phát triển nhanh.  
    2.3.2.2 Chuyển cây ra vườn ươm
  Cây ghép trong ống nghiệm có bộ rễ tự nhiên rất khoẻ, vì vậy khi đưa ra ngoài
đất dễ sống. Cần lưu ý rửa sạch môi trường dinh dưỡng để bộ rễ không bị nấm bệnh.
Đất phân làm bầu nên khử trùng để tránh gây nhiễm bệnh và trồng ở khu vực cách ly
tốt.
    2.3.2.3 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật
  Năm 1838, hai nhà thực vật học người đức Schleiden và Schwann đã đề xướng
thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều gồm nhiều tế bào tạo thành. Các tế
bào đã phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, tế bào
là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể.
  Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schlieden và
Schwann vào thực nghiệm.
  Năm 1922, Kotte học trò của Haberlandt là Robbins đã lập lại thực nghiệm của
Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ  của một cây hòa thảo. Trong môi
trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh tạo nên một
hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ.
  Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô thực vật, khi White nuôi
cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopercium esculentum L.)
với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó ít lâu
White chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng ba loại hỗn hợp
vitamine nhóm B: Thiamine (B1), Pyridoxine (B6), và Nicotinic acid. Từ đó việc nuôi
cấy đầu rễ trong  thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều loại cây khác nhau. Cũng
trong thời gian này Gautheret ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy mô tượng tầng một số cây
gỗ. Sau khi Went và Thimann phát hiện chất điều hoà sinh trưởng (hormone) đầu tiên,
acid – indol acetic (IAA) và đã kết tinh được chất này. 
  Năm 1939, Gautheret đã thành công trong duy trì sự sinh trưởng trong thời gian
vô hạn của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường bằng thạch, bằng cách cấy
chuyền 6 tuần 1 lần.
  Năm 1941, Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa
trong nuôi cấy mô họ cà (Datura). Sau đó vào năm 1948, Steward xác nhận tác dụng
của nước dừa lên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo
thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công. Chất  napthyl  acetic
acid (NAA) và chất 2,4 – dichloro phenoxy acitic acid (2,4 – D) được bắt đầu sử dụng
để trừ cỏ lá rộng trong nông nghịêp. Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4 –
D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật trước
đó rất khó nuôi cấy.
  Năm 1954, Skoog tình cờ thấy nếu thêm một ít chế phẩm đã được để lâu của
acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các
mảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rất rõ rệt. Năm
1955, chất này được xác nhận là 6-furfurylaminopurine và được Skoog đặt tên là
kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bào. Sau này, người ta chứng minh rằng sự
phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hoá học tương tự kinetin điều
khiển và gộp chung các chất này vào nhóm cytokinin. Chất cytokinin đầu tiên được
tách từ thực vật bậc cao là zeatin từ mầm ngô.
  Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu của tỷ lệ kinetin/auxin
trong môi trường nuôi cấy đối với sự  hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi
giảm tỷ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại thì khi tỷ lệ
kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tượng này được
xác nhận trên nhiều loại cây trồng khác nhau và đóng góp  rất lớn vào quá trình điều
khiển sinh trưởng phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành
công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai
đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật là nhân giống cây trồng.
    2.3.2.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật
  Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
  Nuôi cấy mô sẹo
  Nuôi cấy tế bào đơn và protoplast (tế bào trần)
  Nuôi cấy hạt phấn 
  Nuôi cấy mô phân sinh
  Nuôi cấy tế bào lát mỏng
  Nuôi cấy hạt   
2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật vi ghép
  2.4.1 Nghiên cứu trong nước
  Lê Trần Bình (1993), thực hiện thành công vi ghép trong nhân giống cam
chanh.
  Đoàn Thị Ái Thuyền và Nguyễn Văn Uyển (1999), vi ghép thành công cây cam
quýt.  
      Kết quả đạt được qua 2 nghiên cứu trên như sau:  
  Cách ghép chữ T ngược cho kết quả tốt nhất trong thực hiện vi ghép
  Tuổi cây ghép từ 10 – 20 ngày sau khi nảy mầm là tuổi gốc ghép cho kết quả tốt
nhất.
  Mắt ghép càng lớn sẽ cho khả năng  sống của cây ghép càng cao, mắt ghép có
kích thước từ 0,1 – 0,15 mm cho tỷ lệ thành công của cây ghép là 20%; mắt
ghép có kích thước từ  0,2 – 0,3 mm cho tỷ lệ thành công 30%; mắt ghép có
kích thước từ 0,4 – 0,6 mm cho tỷ lệ cây sống 55%.
  Trong một tuần mắt ghép đã đạt kích thước 1,2 – 2 mm và sau 4 tuần chồi ghép
đã có kích thước 15 x 20 mm, rễ của gốc cũng mọc thêm nhiều rễ phụ. Cây
ghép có thể trồng ra đất được.
  Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam (1995) đã tiến hành vi ghép thành công
cây thuộc họ citrus và  tiến hành  trồng  thử nghiệm ở 6 tỉnh khác nhau. Gốc ghép  thứ
nhất là cây Troyer và đỉnh sinh trưởng được ghép lên là các loại cây ăn quả có giá trị
kinh tế. Cây ghép được nuôi trong môi trường MS lỏng với 7,5% đường sau 40 – 60
ngày nuôi cây thì cây có  từ 2 – 3 lá  tuỳ  theo giống, với cách ghép hình  tam giác và
đỉnh sinh trưởng có kích thước 0,1 – 0,16 mm. Gốc ghép lần hai là gốc Volkameriana
được gieo trên giá thể đất. Cây ghép lần hai được nuôi trong thời gian từ  4 – 6 tháng
thì có thể đem trồng ra vườn được.
  Lê Thị Thu Hồng  (1997) đã  tiến hành vi ghép  trên cây thuộc họ cam quýt và
kiểm tra tính chất sạch bệnh của cây vi ghép, kết quả cho thấy 52/53 cây đem kiểm tra
đều sạch bệnh. Từ nguồn vật  liệu ban đầu đến năm 1998 đã sản xuất 5.755 cây sạch 
bệnh  trên gốc Volkameriana gồm 960 cây quýt Đường, 880 cây quýt Tiều, 240 cây
Cam ngọt và 525 cây bưởi Năm Roi.
  2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước
  Năm 1952, Morel và Martin đã thành công khi tạo được cây sạch virus bằng
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi nhiễm virus.
  Roistacher, 1972  đã  xử  lý  cành  ghép  ở  500
C bằng  hơi nuớc  nóng  và  loại  bỏ
được virus gây bệnh “nổ lá”, đồng thời ông cũng chứng minh được rằng có thể xử lý
nhiệt để loại bỏ bệnh lùn cây không rõ nguyên nhân ở cam.
  Huang và Millikan, 1980; Ke và  ctv 1993; Mantel và  ctv, 1997; Navarro va
Juarez, 1997; Perrin và ctv, 1994 đã ứng dụng thành công kỹ thuật vi ghép trên cây táo
để tái sinh cây mới và tạo được cây sạch virus.
  Năm 1991, Navarro và  ctv chứng minh rằng bệnh  loét, bệnh greening và  các
dòng độc của virus tristeza đều có thể loại bỏ bằng kỹ thuật vi ghép.
  Năm 1992, Duran và cộng tác viên đã thành công khi tiến hành vi nhân giống
và nuôi cấy mô cây cam ngọt.
  Năm 1995, Bowman đã thành công khi vi nhân giống gốc của cây citrus.
  Năm 1997, Turbull và ctv đã ứng dụng kỹ  thuật vi ghép để kiểm  tra khả năng
tạo chồi trên cây thuộc họ Arabidopsis. Họ đã sử dụng kỹ  thuật vi ghép đơn giản  (1
gốc ghép – 1 chồi ghép) để kiểm tra sự tương tác giữa gốc ghép với chồi ghép và kỹ
thuật vi ghép hai chồi  trên gốc để nghiên cứu tương tác giữa hai chồi ghép với nhau.
Qua nghiên cứu này, họ đã kết luận được rằng khả năng tạo chồi trên cây ghép do sự
di chuyển từ gốc ghép sang chồi ghép và không có con đường ngược lại. Với phương
pháp vi ghép nhóm nghiên cứu có  thể xác định những gen có  liên quan đến các đặc
tính của cây như  thời gian ra hoa, hệ  thống gen kháng và các phản ứng sinh học với
stress.
  Cùng với kỹ thuật vi ghép này, A. Starrantino và ctv đã ứng dụng để phục hồi
các cây citrus bị nhiễm bệnh virus bằng cách vi ghép đỉnh sinh trưởng  lên gốc được
tạo từ hạt và thu được tỷ lệ sống 40%. Sau khi nghiên cứu các phương pháp ghép khác
nhau và dùng các chất kích thích tăng trưởng họ đã cải thiện được tỷ lệ sống của cây vi  
ghép. Theo nhóm này nếu nhúng đỉnh sinh trưởng và gốc ghép vào dung dịch 6-BAP ở 
nồng độ 0.5 ppm trong 10 phút  trước khi ghép  thì có  thể nâng tỷ  lệ sống của cây lên
73% – 91%, nhưng thường đạt 63%.
  Năm 1999, Carimi và ctv đã tái sinh được phôi vô tính và hình thành cây khi
nuôi cấy lớp mỏng tế bào nhụy của cây citrus.
  Ở Jamaica, Potluri và Sasikala đã tiến hành ghép đỉnh chồi (0.1 – 1 mm) lên
gốc cây kháng và đã thu được kết quả rất tốt.  
  J. Dobranszki và  ctv, 2000 đã nghiên cứu tìm  ra phương pháp  làm  tăng tỷ  lệ
sống của cây táo vi ghép và tạo được điều kiện duy trì sự tiếp xúc tốt giữa gốc và chồi
ghép. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nhúng mặt cắt của gốc ghép và chồi ghép vào
hỗn hợp acid citric 0.15 mg/l, ascorbic acid 0.1 mg/l và gibberellic acid 0.1 mg/l trước
khi ghép sẽ tăng tỷ lệ sống của cây vi ghép lên đến 95%. Một kết quả khác của nhóm
là chồi ghép trước khi đặt vào vị trí ghép trên gốc ghép nếu được nhúng vào dung dịch
agar 0.1% thì khả năng dính của chồi ghép vào gốc ghép tốt hơn, agar làm cho sự dung
hợp giữa gốc và chồi ghép tốt hơn cây ghép thích nghi nhanh và đạt tỷ lệ sống 100%.
  Năm 2001, Emmarol E .Mneney và Sinclair H .Mantell đã thành công khi tiến
hành vi ghép trên cây điều thu được kết quả tỷ lệ thành công của cách ghép là 60% -
80 %, vị trí ghép không có sự khác biệt nhau khi xét trên khă năng thành công. Đồng
thời các nhà khoa học đã tìm ra nồng độ các chất khống chế hoạt chất phenol của cây
điều:  với  200 µM  ascorbic acid cho tỷ  lệ  thành  công là  73%, 2mg/l Diethyl  –
dithocarabamate (DIECA) cho tỷ  lệ  thành  công 55% và  3% (w/v) Polyvinyl
purrolidone (PVP) cho tỷ lệ thành công 41%.
  Năm 2002, A .Onay và ctv đã thành công khi tiến hành vi ghép trên cây đào lạc
kết quả thu được tỷ  lệ  thành công khi ghép là 70% khi cây ở 1 năm tuổi và 90% cây
sống khi đem ra ngoài trồng.
  Năm 2003, trường đại học Rajshahi ở Bangladesh đã thành công khi tiến hành
tái sinh cây bưởi từ mô sẹo và kết quả thu được khi nuôi cấy trên môi trường MS có
chất kích thích sinh tưởng BAP với nồng độ 1 mg/l kết hợp với NAA 5 mg/l  cho khả
năng hình thành mô sẹo tốt nhất và các cây đạt 95% sống khi trồng ra đất.
  Năm 2003, tổ chức FFTC (Food and fertilizer technology center) ở châu Á đã
thành công khi vi ghép trong nhà kính tạo cây cam sạch virus ở tỉnh Nghệ An. 
  Tháng 3 năm 2004, trường đại học của California đã thành công khi tiến hành
ghép chồi lên gốc cây kháng và đã thu được kết quả rất tốt cũng như việc xác định ảnh
hưởng của 2,4 – D, ABA và kinetin lên sự hình thành mô sẹo.
  Năm 2003 Bash, Jonh và ctv đã dùng kỹ thuật vi ghép kết hợp với xử lý nhiệt
và hóa chất để  tạo ra những cây citrus sạch bệnh. Kết quả đã  tạo ra những cây citrus
sạch bệnh mặc  dù  trước  đó  họ  đã  dùng  các  đỉnh  sinh trưởng  dương tính  với Citrus
Tristeza Virus.
 
MỤC LỤC
CHưƠNG  TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ  ..........................................................................................................................  iii  
Tóm tắt  ...............................................................................................................................  iv  
Mục lục  ...............................................................................................................................v
Danh sách các chữ  viết tắt  ...............................................................................................  viii
Danh sách các hình  .............................................................................................................x
Danh sách các bảng .......................................................................................................... xii
Danh sách các biểu đồ  ......................................................................................................  xiii
1. GIỚI THIỆU  ...................................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề  .....................................................................................................................1
1.2 Mục đích - yêu cầu  .......................................................................................................1
  1.2.1 Mục đích  ............................................................................................................1
         1.2.2 Yêu cầu  .............................................................................................................1
1.3 Đối tượng nghiên cứu  ...................................................................................................2
1.4 Phạm vi nghiên cứu  ......................................................................................................2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU  ...............................................................................................3
2.1 Giới thiệu về cây bưởi  ..................................................................................................3
  2.1.1 Nguồn gốc và phân loại  .................................................................................... 3
    2.1.1.1 Nguồn gốc  ..............................................................................................3
  2.1.1.2 Phân loại ................................................................................................4
  2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây bưởi  .......................................................................4
  2.1.3 Các giống bưởi dùng trong thí nghiệm .............................................................6
  3.1.3.1 Các giống bưởi dùng làm chồi ghép  ......................................................6
  3.1.3.2 Các giống bưởi dùng làm gốc ghép  .......................................................7
2.2 Các loại bệnh virus và môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt  ...................8
  2.2.1 Các loại bệnh do virus  .......................................................................................8
  2.2.1.1 Citrus Tristeza virus (CTV)  ...................................................................8 
  2.2.1.2 Citrus tatter leaf virus ( CTLV) .............................................................9
  2.2.1.3 Citrus exocortis virus (CEV) ................................................................10
  2.2.2 Môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt  ...........................................10
  2.2.2.1 Rệp muội hại cây trồng  .........................................................................10
  2.2.2.2 Rệp sáp  hại  cây trồng  ..........................................................................11
2.3 Các cách nhân giống của cây bưởi  ..............................................................................13
  2.3.1 Nhân giống cổ điển ..........................................................................................13
  2.3.1.1 Nhân giống bằng hạt  .............................................................................13
  2.3.1.2 Nhân giống bằng cách chiết cành  .........................................................13
  2.3.1.3 Nhân giống bằng cách giâm cành  .........................................................14
  2.2.1.4 Nhân giống bằng cách ghép  ..................................................................15
  2.3.2 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ...................................................19
  2.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến vi ghép  ........................................................20
  2.3.2.2 Chuyển cây ra vườn ươm  ......................................................................22
  2.3.2.3 Lịch sử  hình thành và phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật  .............22
  2.3.2.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật ..................................................23
2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật vi ghép  ...........................................24
  2.4.1 Nghiên cứu trong nước  .....................................................................................24
  2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước  ....................................................................................25
3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  .......................................................28
3.1 Vật liệu ........................................................................................................................28
  3.1.1 Trang thiết bị và dụng cụ .................................................................................28
  3.1.1.1 Trang thiết bị  .........................................................................................28
  3.1.1.2 Dụng cụ  .................................................................................................28
  3.1.2 Mẫu cấy  ............................................................................................................28
  3.1.3 Môi trường nuôi cấy  .........................................................................................28
3.2 Điều kiện nuôi cấy  .......................................................................................................29
3.3 Phương pháp nghiên cứu  .............................................................................................30
  3.3.1 Bố trí thí nghiệm ..............................................................................................30
  3.3.2 Chỉ tiêu theo dõi  ...............................................................................................31
  3.3.3 Xử lý số liệu  .....................................................................................................31
  3.3.4 Quy trình thí nghiệm  ........................................................................................31 
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  .......................................................................................35
4.1 Tỷ lệ sống của cây vi ghép  ..........................................................................................35
4.2 Khả năng hình thành chồi mới của cây vi ghép ..........................................................40
4.3 Chiều cao chồi của cây vi ghép  ...................................................................................44
4.4 Số lá của cây vi ghép  ...................................................................................................51
4.5 Nhận xét chung  ............................................................................................................56     
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  ...........................................................................................57
5.1 Kết luận........................................................................................................................57
5.2 Đề nghị ........................................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO  .................................................................................................58
Đánh giá : 
0

Facebook Comments Box

X
Hãy điền tên đăng nhập ở Nông nghiệp hữu cơ của bạn.
Điền mật khẩu đi kèm với tên đăng nhập.
Đang nạp