Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật ở vƣờn Quốc gia Cát Tiên

biotechvn
Số bài viết:
447
Số tài liệu đã gửi:
288
Ngày đăng:
08-06-2012
Ngày cập nhật:
28-11-2012 | 01:02:21
Thể loại:
Luận văn - Luận án
Chuyên ngành:
Công nghệ vi sinh
Số lần xem:
1 129
Số bình luận:
0
Ngôn ngữ tập tin:
Tiếng Việt
Bạn phải Đăng nhập để tải tập tin
Hình thức chia sẻ: 
Đường dẫn
Mô tả tài liệu: 

TÓM TẮT
 
  Đề tài “Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích
sinh  trƣởng thực vật ở vƣờn quốc gia Cát Tiên”  được thực hiện ṭi tṛi thực
nghiệm sinh học, Đ̣i học Khoa học Tự nhiên, Đ̣i học Quốc gia thành phố Hồ Chí
Minh từ th́ng 3/2007 đến th́ng 8/2007.
  Kết quả:
  - Phân ḷp và làm thuần   được 75 chủng vi sinh ṿt từ vườn Quốc Gia Ćt
Tiên.  Trong đ́ ć 45 chủng trên môi trường chọn lọc MMS (khóng MS+1%
methanol) và 30 chủng trên môi trường chọn lọc MSo (môi trường MS lọi bỏ ćc
thành phần chứa nitrogen).
  - Sàng lọc qua 2 hệ thống (khả năng t́c động lên chồi thuốc ĺ trong điều kiện
in vitro và khả năng   kích thích ḥt nảy mầm của ḥt đ̣u xanh trong điều kiện  in
vivo),  ch́ng tôi chọn lọc được 9 chủng vi sinh ṿt  ć khả năng kích thích sinh
trưởng trên thực ṿt bao gồm: 6012a, 6019a, 6019b, 6021a, 6027a, ON16a, ON20a,
ON28a và ON29b.
     Kết quả định danh:  
  Chủng 6012a và 6027a được định danh tới cấp độ giống là vi khuẩn  thuộc chi
Methylobacterium. Riêng chủng 6012a ć thể là một loài mới.
  Ćc chủng 6019a, 6019b, 6021a, ON16a, ON20a, ON28a, ON29b là nấm men
và ć đặc điểm tương đồng với ćc giống nấm men sau:
-  Ćc chủng 6019b, ON16a,  ON20a,  ON29b  ć điểm tương đồng với giống
Pichia.
-  Chủng 6019a ć điểm tương đồng với giống Cocidiascusc.
-  Chủng 6021a ć điểm tương đồng với giống Rhodotorula.   
-  Chủng ON28a ć điểm tương đồng với giống Endomycopsis.  
  v

   
1
 
 
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1   
1.1  Đặt vấn đề
Từ xưa đến nay,  năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của
mọi nền nông nghiệp. Do đ́ đã ć rất nhiều phương ph́p được sử dụng nhằm cải
thiện năng suất cũng như tăng cường sức đề kh́ng của cây trồng với mầm bệnh
trong đ́ phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân b́n hó học. Tuy nhiên ćc
biện ph́p này còn rất nhiều ḥn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thói hó đất và
ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người. Cùng với sự ph́t triển của khoa học kỹ
thụt, ćc biện ph́p và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền
nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đ̣t năng suất cao. Bên
c̣nh đ́, gần đây nhiều công bố khoa học cho thấy tiềm năng sử dụng tương t́c ć
lợi giữa vi sinh ṿt với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực ṿt, trong đ́ ćc
vi sinh ṿt ć khả năng cố định nitrogen và biến dưỡng methyl đang thu h́t được
rất nhiều sự quan tâm.  
Khả năng kích thích sinh trưởng thực ṿt của ćc chủng vi sinh ṿt này được
biết đến thông qua cơ chế cố định đ̣m hoặc sự sản sinh ćc hợp chất sinh học như
ćc phytohormone, vitamin và cả một số lọi enzyme ć khả năng ức chế sự ph́t
triển của mầm bệnh qua đ́ kích thích sinh trưởng của cây chủ. Chính bởi những ưu
điểm này mà việc tìm ra ćc chủng vi sinh ṿt ć khả năng kích thích sinh trưởng
thực ṿt đang là một hướng đi đầy tiềm năng. Đặc biệt trong điều kiện nước ta là
một trong những quốc gia ć đa ḍng sinh học phong ph́ với ćc khu bảo tồn thiên
nhiên còn hoang dã, thì tiềm năng tìm thấy ćc chủng vi sinh ṿt ć ích trên là rất
lớn.   
   
2
Trên những cơ sở đ́, ch́ng tôi tiến hành đề tài:
“ Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh
trƣởng thực vật ở vƣờn Quốc gia Cát Tiên”.
 
1.2  Mục tiêu
  Phân ḷp và tuyển chọn những vi sinh ṿt ć đặc tính tương t́c thực ṿt để
ứng dụng trong nông nghiệp.
  Định danh để tìm kiếm ćc loài mới.
1.3  Yêu cầu
  Phân ḷp và làm thuần được một số chủng vi sinh ṿt ć khả năng biến
dưỡng methyl và cố định nitrogen ở vườn Quốc gia Ćt Tiên.
  Khảo śt để chọn lọc những vi  sinh ṿt kích thích sinh  trưởng thực ṿt từ
những chủng phân ḷp được.
  Bước đầu định danh ćc chủng vi sinh ṿt ć khả năng kích thích sinh trưởng
thực ṿt dựa vào ćc đặc điểm hình th́i, sinh lý, sinh hó và sinh học phân
tử.
 
 

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2   
2.1  Vƣờn Quốc gia Cát Tiên [23]
  Vườn Quốc gia Ćt Tiên (VQGCT) nằm trên vùng chuyển tiếp từ cao nguyên
xuống đồng bằng qua địa pḥn ba tỉnh: huyện Ćt Tiên, Bảo Lâm (tỉnh Lâm Đồng);
Bù Đăng (tỉnh Bình Phước); Vĩnh Cửu, Tân Ph́ (tỉnh Đồng Nai). Chính vì thế
vườn ć nhiều ḍng địa hình: từ ńi cao, sườn dốc, đồi nhấp nhô cho đến thềm sông
bằng phẳng, nhiều th́c ghềnh, suối lớn và những vùng đầm lầy ng̣p nước. VQGCT
ćch  thành phố Hồ Chí Minh  150km với tổng diện tích là 73878 ha, tài nguyên
thiên nhiên phong ph́, đa ḍng và là một trong những Vườn Quốc gia lớn nhất Việt
Nam.
  Hệ thực vật
  Vườn Quốc gia Ćc Tiên ć nhiều ḍng sinh cảnh: rừng nguyên sinh và thứ
sinh trên đất  thấp ưu thế bởi ćc loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae); rừng nửa
rụng ĺ nguyên sinh và thứ sinh trên đất thấp ưu thế bởi ćc loài Lagertroemia sp.
đất ng̣p nước ngọt và trảng cỏ ng̣p nước theo mùa ưu thế bởi ćc loài Saccharum
sp.  rừng ng̣p lụt ưu thế bởi ćc loài Hydrocarpus sp. xen lẫn Ficus benjamina và
ćc kiểu sinh cảnh thứ sinh như rừng tre nứa, trảng  cỏ... Hệ thực ṿt đã ghi nḥn
1362 loài thực ṿt ḅc cao ć ṃch, trong số đ́ ć 34 loài ć tên trong "Śch Đỏ"
Việt Nam và nhiều loài cây gỗ ć gí trị như gõ đỏ, xoay, cẩm lai, gíng hương quả
to
  Hệ động vật  
   
4
  Theo thống   ghi nḥn 77 loài th́, 318 loài chim, 58 loài bò śt, 26 loài ếch
nh́i, 130 loài ć. Trong số đ́ ć ćc loài th́ lớn quý hiếm và một số loài ć nguy
cơ đe dọ tuyệt chủng toàn cầu như tê gíc Java, bò t́t, voi Châu Á, ć sấu nước
ngọt (Crocodylus siamensis); một số loài chim đặc hữu như gà so cổ hung
(Arborophila davidi), gà tiền mặt vàng (Polyplectron germani), một số loài chim
nước quý hiếm như qúm ćnh xanh (Pseudibis davisoni), ngan ćnh tŕng (Cairina
scutulata), già đẫy nhỏ (Leptoptilos javanicus). Đối tượng bảo tồn là rừng cây họ
Dầu, ćc hệ sinh th́i đặc thù, ćc loài tê gíc, ć sấu, bò t́t, ćc loài chim đặc hữu.
VQGCT thực sự là kho b́ch khoa toàn thư sống cho công t́c nghiên cứu thế giới tự
nhiên
2.2  Sơ lƣợc sự tƣơng tác giữa vi sinh vật và thực vật  
  Ćc vi khuẩn tương t́c với thực ṿt rất đa ḍng về giống loài và cơ chế tương
t́c với thực ṿt. Những vi khuẩn này là một bộ pḥn quan trọng trong qú trình
ph́t triển của thực ṿt. Mặc dù ćc nghiên cứu về vi khuẩn tương t́c thực ṿt chủ
yếu ṭp trung vào ćc vi sinh ṿt gây bệnh trên thực ṿt và ćc vi sinh ṿt cố định
nitơ. Tuy nhiên, mối quan tâm về sự đa ḍng của ćc vi sinh ṿt  kích thích sinh
trưởng thực ṿt đã và đang gia tăng. Và thực tế trong tự nhiên ć nhiều lọi vi sinh
ṿt ć khả năng kích thích sinh trưởng  thực ṿt, nhưng ch́ng chỉ chiếm một tỷ lệ
nhỏ trong quần thể vi sinh ṿt. Những vi sinh ṿt này ć vai trò quan trọng trong
nông nghiệp hay môi trường. Những tiến bộ kỹ thụt trong sinh th́i và di truyền vi
sinh ṿt đã và đang ph́t hiện ra nhiều loài vi sinh ṿt ć ích, ć t́c động tích cực
lên sự sinh trưởng và ph́t triển của thực ṿt. Đồng thời cũng làm śng tỏ ćc cơ chế
tương t́c giữa thực ṿt và vi sinh ṿt, làm nền tảng cho việc ứng dụng ćc vi sinh
này vào cuộc sống [18].
  Ćc vi sinh ṿt tương t́c với thực ṿt không chỉ bao gồm ćc vi sinh ṿt tiền
nhân (Prokaryote) mà ń còn cả ćc vi sinh ṿt nhân thực (Eukaryote):
  + Prokaryote là thành phần chiếm đa số của hầu hết ćc quần thể vi sinh ṿt
trong thực ṿt. Ćc prokaryote này, thường là vi khuẩn ć thể hiện diện với ṃt độ  
   
5
lên tới 109
tế bào trên 1 gram mô rễ. Nếu nuôi cấy ch́ng trên môi trường chọn lọc
ć thể đ̣t 1010
 tế bào trên 1 gram sinh khối thực ṿt [18].
  +  Eukaryote  bao gồm nấm sợi, nấm men, tảo, protozoa và ćc tuyến trùng
thường ṭp trung với ṃt độ thấp hơn ćc prokaryote. Một thí dụ rõ ràng  là ćc vi
sinh ṿt cộng sinh trên rễ ć thể đ̣t lượng tế bào trên 1 gram mô rễ là: 106
-109
  tế
bào vi khuẩn, 107
x̣ khuẩn, 105
-106
  tế bào nấm men, 103
đối với tảo, 102
-103
 đối
với protozoa. Bacteriophage và ćc lọi virus cũng  là thành viên của quần thể này,
ch́ng ć thể tìm thấy trong đất với ṃt độ 108
-109
 tế bào trên một gram đất [6].  
  Vi sinh ṿt tương t́c thực ṿt ć thể phân nh́m dựa vào nơi cư tŕ, và bản
chất t́c động của ch́ng lên thực ṿt.  
  Phân nh́m dựa vào nơi cư tŕ bao gồm
  Các vi sinh vật biểu sinh  (epiphyte): bao gồm ćc vsv cộng sinh ở vùng rễ
(Rhizosphere) và vsv cộng sinh trên bề mặt ĺ (Phyllosphere). Phần lớn ćc vi sinh
ṿt biểu sinh tương t́c thực ṿt sống bằng ćc chất dinh dưỡng thót ra trên bề mặt
cây.  Ví dụ vùng rễ thường tiết ra nhựa keo (dịch nhày) chứa: Hydrat
polysaccharide, acid hữu cơ, vitamin, và amino acid, đ́ là điều kiện tối ưu đối với
một gí thể mà vi sinh ṿt cần cho sự sinh trưởng và ph́t triển. Nhựa keo được bao
bọc bởi nước, và như thế gíp làm môi trường thủy giải tốt đối với rễ và vi sinh ṿt
vùng rễ ph́t triển [16].
  Ở vùng ĺ, nguồn thức ăn cho ćc vi sinh ṿt là dịch ĺ tiết ra. Trong nh́m vi
sinh ṿt vùng ĺ thì vi khuẩn biến dưỡng methyl tùy ý (Pink-pigmented facultatively
methylotrophic, PPFM) chiếm tỉ lệ lớn và ń được phân bố trên nhiều lọi cây.  
[14]. Ch́ng sử dụng nguồn carbon là nguồn methanol do cây tiết ra  từ qú trình
phân hủy ćc pectin ć methyl. Nhờ khả năng sử dụng nguồn thức ăn kh́c thường
này, PPFM ć thể lọi bỏ ćc chất độc này khỏi mô thực ṿt, và ć chỗ cư ngụ trên
ĺ. Ćc PPFM sử dụng nguồn carbon, và ćc khóng chất từ cây chủ, đồng thời
tham gia vào ćc qú trình sinh h́a chuyển h́a quan trọng của cây chủ [19] (Hình
2.1).
 
   
6
Đa số ćc vi sinh ṿt này không làm thay đối sự sinh trưởng và sinh lý của cây. Do
đ́, phần lớn vi sinh ṿt tương t́c thực ṿt ć một tương t́c hội sinh
(commensalisti) với cây chủ.
 
 
 
Hình 2.1:  (A) Qú trình chuyển h́a hợp chất 1 carbon ở  vi sinh ṿt biến dưỡng
methyl
(B) Khuẩn ḷc Methylobacterium từ cỏ ba ĺ trên môi trường phân ḷp [20]
 
Các vi sinh vật nội sinh (endophytic)  
  Ćc vi sinh ṿt nội sinh (endophytic) là ćc vi sinh ṿt sống bên trong mô thực
ṿt sống và không gây ḥi tới cây chủ. Ch́ng được phân ḷp từ bề mặt mô hay chiết
xuất từ mô thực ṿt. Mặc dù, ćc lọi nấm endophytic đã được nghiên cứu rộng rãi
trong khi ćc vi khuẩn endophytic thì chưa, ćc vi khuẩn này vẫn thu h́t được sự
quan tâm nhờ vào tiềm năng sử dụng của ch́ng trong nông nghiệp.
  Ćc  vsv  nội sinh  được phân ḷp từ nhiều lọi mô và cây khỏe ṃnh.
Kobayashi và Palumbo (2000) đã biên sọn một danh śch 55 giống và 144 loài
endophytic phân ḷp từ rễ, thân, hoa, ḥt, quả của nhiều loài thực ṿt [14].   
   
7
2.2.1  Phân nhóm vi sinh vật tƣơng tác với thực vật dựa vào bản chất của sự
tƣơng tác [16]
  Theo bản chất của sự tương t́c thì ćc vi sinh ṿt tương t́c được chia làm 2
nh́m: nh́m vi sinh ṿt ć lợi cho thực ṿt và nh́m vi sinh ṿt gây bất lợi cho thực
ṿt.   
  Ćc vi sinh ć lợi chiếm ưu thế là ćc vi sinh ṿt kích thích  sự sinh ở thực ṿt
sinh trưởng. Việc tìm hiểu và x́c định ćc cơ chế này rất kh́ khăn do sự đa ḍng
của ćc cơ chế. Đối với ćc vi sinh ṿt cố định đ̣m, sự kích thích sinh trưởng chỉ
thấy rõ khi cây sống trên vùng đất nghèo đ̣m. Đến nay khả năng kích thích sinh
trưởng thực ṿt đến nay được hiểu theo 4 con đường chính
- Gia tăng lượng ćc chất dinh dưỡng ở ḍng dễ sử dụng cho cây
-  Sản xuất ćc phytohormone kích thích sinh trưởng thực ṿt
-  Tăng cường ảnh hưởng ć lợi của ćc tương t́c cộng sinh
-  Giảm t́c động ć ḥi của ćc mầm bệnh.
2.2.1.1  Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật: thường được
tìm thấy ở ćc vi sinh ṿt nội sinh. Ćc vi sinh ṿt nội sinh  bảo vệ cây khỏi sự tấn
công của ćc mầm bệnh bằng ćc cơ chế sau:
  Cạnh tranh về nơi ở và dinh dƣỡng
  Ćc endophyte thuộc nh́m này ć khả năng sinh sản rất nhanh ch́ng, ch́ng
vượt qua số lượng ćc mầm bệnh trong cây và ức chế sự sinh sản cũng như dinh
dưỡng của mầm bệnh. Ví dụ điển hình trong trường hợp này là một số lọi nấm
men. Sự sinh sản bằng ćch nảy chồi khiến nấm men nhân lên số lượng một ćch
nhanh ch́ng và khiến sự nảy mầm của ćc bào tử B. cinerea hoàn toàn bị ức chế.
  Sự tổng hợp các loại hợp chất thứ cấp  
  Trong nhiều nghiên cứu người ta nḥn thấy ćc vi sinh ṿt nội ć sự sản sinh
ra ćc lọi hợp chất thứ cấp ć họt tính của kh́ng sinh do đ́ ch́ng ć khả năng ức
chế và tiêu diệt một số lọi nấm bệnh.
  Như trường hợp của 2 lọi kh́ng sinh tự nhiên do Sporothrix floccolosa sản
xuất ra là: heptadeceonic và methyl-hepadecenoic acid ć khả năng kh́ng khuẩn và  
   
8
kh́ng một số lọi nấm như: B. cinerea, Fusarium oxysporum sp. Urquhart và Punja
(2002) cũng đã tinh chế một ester acid béo với họt tính kh́ng nấm từ Tilletiopsis
pallescens.  
  Enzyme phân hủy vách tế bào [16]
  Nhiêu nghiên cưu cho thây , ćc vi sinh ṿt tương t́c thực ṿt ć khả năng sản
sinh ra cac loai enzyme phân huy thanh lysis cua tê bao cac loai mâm bênh như :
enzyme chitinase, β-1,3-glucanase...
  Môt sô loai nâm men như  Pichia anomala, P. membranifaciens,R. glutinis, C.
laurentii, A. pullulans, Tilletiopsis albescens, ṭo β-1,3-glucanase chông  lai cac loai
nâm gây bênh trên la va trên qua như :  A. niger, Sphaerotheca fuliginea,  P. xanthii
(Urquhart,  1994;  Castoria,  1997;  Jijakli va Lepoivre  1998;  Castoria va công sư ,
2001; Masih va Paul  2002). Trong công trình của Madhaiyan và cộng sự (2004)
cũng đã chứng tỏ mối tương quan giữa khả năng kh́ng bệnh của cây ĺa khi xử lý
với vi khuẩn Methylobactreium  sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây
[16].  
  Kích thích phản ứng ph̀ng vệ ở cây chủ
  Sư cam ưng  này  liên quan đên viêc san xuât môt sô hơp chât như
phenylalanine ammonia lyase phytoalexin, peroxidase va ethylene  trong mô tê vao
thưc vât.
2.2.1.2  Vi sinh vật gia tăng dinh dƣỡng cho cây [16]   
  Khả năng cố định nitơ (biến đổi nitơ thành amonia) chủ yếu giới ḥn trong giới
prokaryotes nhưng đa ḍng giữa ćc giống vi khuẩn. Nằm trong số gần 100 lọi cố
định nitơ (diazotrophic), chỉ ć một vài lọi ć tính chuyên biệt cao, ćc tương t́c
ṃt thiết ć thể ṭo một cơ quan mới hay một cơ quan ć cấu tŕc giống với cơ quan
của cây chủ. Tương t́c đ̣t cực đ̣i khi ch́ng chuyển sang cố định nitơ cho cây chủ,
theo đ́ cung cấp một lượng dinh dưỡng cho cây chủ. Ngược ḷi cây chủ cũng gíp
bảo vệ vi khuẩn khỏi điều kiện môi trường và cung cấp ćc hợp chất giàu năng
lượng  cho họt động cố định nitơ. Ćc vi sinh ṿt cố định đ̣m bao gồm vi khuẩn
cộng sinh trên cây họ đ̣u, ćc vi sinh ṿt tự do cố định đ̣m, ćc vi khuẩn lam…  
   
9
  Vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu
  Nghiên cứu điển hình nhất về tương t́c cộng sinh giữa vi khuẩn và thực ṿt là
tương t́c giữa vi khuẩn ṭo nốt sần trên rễ và ćc cây họ đ̣u. Ćc cây thuộc họ này
bao gồm: đ̣u hòa lan, đ̣u nành, đ̣u lăng và cỏ linh lăng cũng như ćc lọi cỏ trinh
nữ, cây keo…
  Ngày nay, ćc nghiên cứu cho thấy vi khuẩn cộng sinh được phân lọi thành
vài giống, và ćc loài chuyên biệt nhất thuộc giống   Rhizobium, Sinorhizobiu,
Mesorhizobium, Bradyrhizobium.  
  Hầu hết ćc vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đ̣u đều ṭo ra nốt sần trên rễ (ćc
nốt sần này là những tín hiệu cho thấy ć sự tương t́c giữa vi khuẩn và cây trồng).
Và trong sự đ́p ứng này,  ć sự sản xuất ćc  phân tử tín hiệu
lipochitooligosaccharide thường được gọi là ćc nhân tố Nod. Ćc nhân tố Nod
khiến ćc sợi rễ xón ḷi, ḥn chế sự  thủy phân của thành tế bào bên trong ćc nốt
xón, sự lõm vào của màng plasma, sự ĺng đọng của ṿt liệu ṭo v́ch tế bào mới
ṭo ra dòng xâm nhiễm. Ch́ng giữ vai trò như một đường ngõ đi vào mô cây. Vi
khuẩn phân chia bên trong ćc dòng này khi ch́ng ph́t triển xuyên qua nhiều lớp
vỏ tế bào trong rễ. Một số loài vi khuẩn cộng sinh cây họ đ̣u kh́c ḷi xâm nḥp vào
cây thông qua ćc lỗ hổng ở biểu bì và di chuyển xuống vùng gian bào của rễ, ć
hoặc không ć sự hình thành ćc dòng xâm nhiễm.  
  Ở một vài loài cây chủ như là cỏ linh  lăng và đ̣u hà lan, vi khuẩn gây ra sự
phân chia trực phân bên trong vỏ tế bào và gây nên ćc nốt sần bất định (ćc nốt sần
này tiếp tục kéo dài phụ thuộc vào sự liên tục của  mô phân sinh ở đỉnh); ở ćc cây
chủ kh́c như đ̣u nành, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân của vùng bên ngoài
lớp vỏ tế bào và dẫn đến sự hình thành nốt sần bất định. Ở hai trong số 3 phân họ
cây họ đ̣u (Mimosoideae  và  Papilionoideae), vi khuẩn di chuyển từ dòng xâm
nhiễm vào trong tế bào chất của tế bào cây chủ bằng cơ chế nḥp bào (endocytosis).
Ń cho phép vi khuẩn được bao bọc bởi màng tế bào thực ṿt. Ćc vi khuẩn ở trong
vùng gian bào và nội bào này được gọi là ćc bacteroid, phân chia cho đến khi
ch́ng chiếm đầy tế bào cây chủ và phân h́a thành ḍng giàu nitrogenase, enzyme  
   
10
Sự gia
tăng độ
mật
thiết của
các
tƣơng
tác
1.  Vi sinh vật cộng sinh cƣ trú ở vùng gian bào
(Endosymbionts)
Ví dụ: vi khuẩn cộng sinh gây nốt sần trên rễ cây họ đ̣u
2.  Vi sinh vật cƣ trú ở vùng ngoại bào
(Ectosymbionts)
Ví dụ: tương t́c giữa vi khuẩn lam và một số loài thực ṿt
ḅc thấp
3.  Vi sinh vật bên trong mô cây chủ (Endophytes)
Ví dụ: Herbaspirillum sp. ở cây mía đường
4.  Vi sinh vật chỉ sống trên bề mặt cây
  Ví dụ:  Azospirillum và Klebsiella
 
 
 
 
 
 
quan trọng để cố định nitơ. Trong phân họ Caesalpinoideae, ćc vi khuẩn không rời
khỏi trong dòng xâm nhiễm thay vào đ́, ćc dòng xâm nhiễm phân nh́nh cho đến
khi ń chiếm đầy tế bào chủ. Sự cố định  nitơ chỉ xảy ra khi nồng độ oxi tự do trong
nốt sần đủ thấp để cho phép  kích họt enzyme nitrogenase. Protein liên kết oxy
leghemoglobin ở thực ṿt (ć chức năng liên quan tới hemoglobin, giữ vai trò làm
giảm lượng oxy khi xử dụng oxy để hô hấp).  
  Ngoài ra còn ć ćc ćc sinh ṿt nội bào cố định đ̣m không hình thành nốt
sần (diazotrophic endophyte) đã được phân ḷp từ một số lọi cây thân thảo như:
b́p, ĺa, mía đường, ĺa mì…ví dụ điển hình về vi khuẩn nội bào cố định đ̣m là
Gluconacetobacter diazotrophicus  (trước đây là  Acetobacter diazotrophicus),  
Herbaspirillum spp ở cây mía, Alcaligenes, Azospirillum, Bacillus, Enterobacter, ,
Klebsiella, Pseudomonas và Rhizobium  trên ĺa và b́p (James, 2000). Khi chủng
ćc lọi vi khuẩn nay lên rễ, ch́ng sẽ xâm nhiễm vào rễ và nhiều khi là vào hệ
thống mô ṃch ṭo thành ćc quần thể vi sinh ṿt trong vùng gian bào và ć thể đ̣t
nồng độ 101
- 107
 tế bào  trên 1 gram trọng lượng tươi [16].
  Vi sinh vật tự do cố định nitơ
  Đây là  ćc lọi vi khuẩn tương t́c thực ṿt cố định đ̣m nhưng không xâm
nḥp vào một lọi cây chủ theo hướng cộng sinh chuyên biệt.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hình 2.2: Phổ tương t́c cố định
đ̣m trên thực ṿt [16].
 
   
11
     Hầu hết ćc prokaryote cố định nitrogene sống tṛng th́i  tự do. Sự cố định
nitrogen ở vùng rễ phổ biến hơn do việc cố định nitrogen cần năng lượng lớn, và
vùng rễ cây là vùng giàu carbohydrate.
  Ćc loài Azospirillum là những loài cố định nitrogen đầu tiên được phân ḷp từ
rễ cây và ń ć ćc đặc tính tốt nhất của ćc loài sinh ṿt cố định đ̣m tương t́c
thực ṿt. Không giống ćc sinh ṿt nội sinh cố định đ̣m như Gluconacetobacter
diazotrophicus  và Herbaspirillum sp. (nội sinh b́t buộc), Azospirillum sp. là nh́m
nội sinh không b́t buộc. Ch́ng vừa sống được cả nội sinh và trên vùng rễ.  
 
 
  Bên c̣nh nitrogen thì phosphate là lọi dinh dưỡng khóng thứ hai ảnh hưởng
nhiều lên sinh trưởng của cây. Lượng phosphate  trong đất rất dồi dào nhưng phần
lớn đều ở ḍng chưa hòa tan. Nhiều loài vi sinh ṿt rễ ć thể hòa tan ćc phosphate
vô cơ bằng ćch tiết ra ćc acid hữu cơ, như gluconic acid và 2-ketogluconic acid,
hay ć thể khóng h́a phosphate vô cơ bằng ćch tiết enzyme ngọi bào
phosphatases. Một số loài vi khuẩn kh́c sản xuất ćc hợp chất hữu cơ (gọi là
siderophore) ćc chất này kết hợp với Fe
3+
, khiến ń dễ chuyển đổi thành ḍng dễ
sử dụng hơn (Fe
2+
) [16].  
 
 
Hình 2.3. Azospirillum brasilense bề mặt
của rễ lúa [20]  
   
12
2.2.2  Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trƣởng ở thực vật.
2.2.2.1  Enzymes:  
  Một số nghiên cứu cho thấy ć  sự tổng hợp  ACC  deaminase  (1-
aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase)  từ ćc vi khuẩn kích thích sinh
trưởng thực ṿt ở vùng rễ (Li và ctv., 2000) như: Methylobacterium sp., Alcaligenes
spp. Bacillus pumilus, Enterbacer cloacae, burkholderia cepacia, Pseudomonas
putida, Pseudomonas spp.và Variovorax paradoxus [19]. Cơ chế này được lý giải là
do ACC ć khả năng làm giảm ethylen trong rễ (mà ethelen này ức chế sự sinh
trưởng của rễ) do đ́ kích thích rễ ph́t triển.   
2.2.2.2  Phytohormone:
  T́c động kích thích lên sinh trưởng thực ṿt thường  là do sự sản xuất ćc
phytohormone. Phytohormone phổ biến nhất là auxin indole-3-acetic acid (IAA). đã
ć nhiều nghiên cứu về sự sản xuất auxin này ở ćc loài vi khuẩn như: Azospirillum
brasilense, Aeromonas veronii,  Agrobacterium  sp.,  Alcaligenes piechaudii,
Bradyrhizobium  spp.,  Comamonas acidovorans, Enterobacter sp.,  và Rhizobium
leguminosarum [19]. Tuy nhiên ć rất ít ćc vi sinh ṿt ć khả năng tổng hợp IAA
để kích thích sự sinh trưởng ở thực ṿt. Ch́ng thường là ćc vi khuẩn gây bệnh như
Argobacterium tumefaciens, A. rhizogenes và P. syringae pv.  
  Một số quan śt cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sống cộng sinh trên
thực ṿt mà không gây bệnh cho cây chủ, ngược ḷi ch́ng còn ć khả năng hỗ trợ
cây chủ ph́t triển rất tốt. Holland và Polacco (1994) đã nghiên cứu về
Methylobacterium, cytokinin và sự ph́t triển của thực ṿt bằng ćch đun ḥt đ̣u
nành (500
C trong 4 giờ) để giảm khả năng nảy mầm xuống khoảng 30%. Khi đ́
ṃt độ PPFM nhiễm ở ḥt cũng đồng thời giảm xuống 90%. Việc bổ sung cytokinin
(benzyl adenine + zeatin 0,5 mg/l) vào ćc ḥt này ć t́c dụng phục hồi tỉ lệ nảy
mầm. Bổ sung PPFM vào môi trường ḥt nảy mầm cũng ć t́c dụng tương tự như
t́c dụng của cytokinin  [10]. Kết quả này phù hợp với giả thuyết cho rằng PPFM
ảnh hưởng đến lượng cytokinin ć trong mô tế bào thực ṿt.  
   
13
  Koenig và cộng sự (2002), nghiên cứu về mối liên hệ giữa Methylobacterium
sp. và thực ṿt ở mức phân tử. Họ chứng minh bốn loài Methylobacterium sp. phân
ḷp từ ĺ và loài M. extorquens đều ṭo ra cytokinin là trans-zeatin ở mức rất thấp và
tiết vào môi trường nuôi cấy [15].
  Tuy nhiên, kết quả của Koenig và cộng sự đã cung cấp bằng chứng về cơ chế
tổng hợp cytokinin ở ćc chủng Methylobacterium, là tiền đề cho ćc nghiên cứu về
mối quan hệ giữa Methylobacterium và thực ṿt. Hơn nữa, bằng chứng về một vi
khuẩn hội sinh ṭo phytohormone đã đưa đến ći nhìn thấu đ́o hơn về vai trò của vi
khuẩn Methylobacterium sp. với thực ṿt.
  Kết quả: Methylobacterium  sp. ć khả năng tổng hợp cytokinin phù hợp với
những kh́m ph́ kh́c  và  một số  dinh dưỡng methyl kh́c (như  Methylomonas
methanica, Methylovorus may)  ć khả năng tổng hợp cytokinin [7]. Hơn thế nữa,
Joshi Jagmoha và Holland (2001) đã đưa ra giải ph́p tăng năng suất bằng ćch
phun PPFM lên cây trồng [21].
  Bên c̣nh đ́ năm 2004, Omer và cộng sự đã khảo śt sự hiện diện của IAA
trong môi trường chứa dịch nuôi cấy  vi khuẩn biến dưỡng methyl. Qua đ́, ph́t
hiện thấy ć 3 trong 16 chủng phân ḷp ć phản ứng dương tính với với thuốc thử
Salkowski. Điều này được chứng minh rõ hơn bằng phương ph́p śc lý lỏng cao ́p
(HPLC) kết hợp với phân tích phổ NMR (nuclear Mangnetic Radiation: cộng hưởng
từ ḥt nhân). Ba chủng ṭo ra IAA ć hàm lượng phytohormone từ 6 - 13,3 mg/l nếu
bổ sung L-tryptophan (L-TRP). Khi không bổ sung L-TRP thì nồng độ IAA ṭo ra
chỉ từ 1.1 – 2,4 mg/l [17], [9].
  Ćc kết quả này đã gây được sự ch́ ý lớn. Agricell Report  nhấn ṃnh: “Việc
khảo śt về khả năng vi khuẩn dinh dưỡng methyl kích thích tăng trưởng và ph́t
sinh hình th́i thực ṿt trong điều kiện  in vitro  là rất lý  th́ và mang ḷi rất nhiều
triển vọng”.  
  Hy vọng rằng ćc nghiên cứu về mặt sinh lý, sinh hó và cơ chế phân tử của vi
khuẩn dinh dưỡng methyl tương t́c với thực ṿt sẽ đem ḷi những hiểu biết hơn về  
   
14
nguyên lý của mối quan hệ này đồng thời mở ra hướng ứng  dụng mới của công
nghệ sinh học trong nông nghiệp ở điều kiện in vitro và in vivo.
2.3  Các phƣơng pháp định danh vi sinh vật
  Từ lâu thì việc định danh vi sinh ṿt cần phải khảo śt ćc đặc điểm hình th́i
và ćc đặc điểm sinh lí, sinh h́a của vi sinh ṿt. Đồng thời, phương ph́p sinh học
phân tử giải trình tự đọn gen đặc trưng của vi sinh ṿt cũng được tiến hành để cho
kết quả nhanh ch́ng và chính x́c.  
2.3.1  Phƣơng pháp truyền thống
  Việc phân lọi vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad
Cohn phân nh́m vi khuẩn dựa vào hình ḍng tế bào. Mặc dù phương ph́p phân
lọi dựa vào hình th́i sớm cho thấy không ć hiệu quả trong phân lọi, nhưng hình
th́i và đặc điểm cấu tŕc hiển vi vẫn ć vai trò quan trọng trong định danh vi sinh
ṿt, đặc biệt là trong việc định danh ćc chủng mới [1].   
  Phương ph́p truyền thống để định danh vi sinh ṿt thường dựa vào ćc chỉ
tiệu phân lọi như: đặc điểm hình th́i, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng.
Trong đ́ ćc thử nghiệm để x́c định ćc đặc điểm sinh lý, sinh h́a là ćc chỉ tiêu
quan trọng nhất [22].
  Sữ dụng khóa phân loại
  Thông thường để định danh ćc loài vi khuẩn mục tiêu theo phương thức
truyền thống, người ta thường dựa vào ćc kh́a phân lọi, trong đ́ kh́a phân lọi
Prokaryote đầy đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là kh́a phân lọi Bergey (Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology) [3].
  Riêng đối với nấm men việc định danh theo phương thức truyền thống rất
phức ṭp. Từ trước đến nay ć rất nhiều kh́a phân lọi nấm men của nhiều t́c giả
kh́c nhau. Hansen là người đưa ra kh́a phân lọi nấm men đầu tiên. Trong kh́a
phân lọi này, Hansen chia nấm men thành 8 giống. Sau Hansen, Klocker (1907),
Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh sữa kh́a phân lọi của Hansen, nhưng
chưa được hoàn thiện [2].  
   
15
  Đến năm 1952, J. Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết ḷi một ćch kh́ hoàn
thiện vấn đề phân lọi nấm men và xuất bản một tài liệu rất ć gí trị (J. Lodder and
N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952, the yeast, a taxonomic study, North Holland, Pub Co.
Amsterdam), được xuất bản lần thứ hai năm 1957. Năm 1970, J. Lodder bổ sung
sửa chữa ḷi và in t́i bản lần thứ nhất năm 1970, lần thứ hai 1971. Đây là tài liệu
phân lọi nấm men rất ć gí trị và và là kh́a phân lọi thông dụng nhất hiện nay
trên thế giới. Hệ thống phân lọi này dựa trên kiểu phân chia tế bào, hình th́i bào tử
nang và đã x́c định 349 loài nấm men thuộc 39 chi kh́c nhau [2].
  Sử dụng phƣơng pháp số học  
  Ngoài ra, dựa vào những thông tin về đặc điểm của vi sinh ṿt, người ta còn ć
thể tính hệ số tương đồng để đ́nh gí mức độ tương đồng giữa ćc chủng vi sinh
ṿt. Trong đ́ hệ số Jaccard được sử dụng để so śnh mức độ tương đồng giữa hai
chủng khi muốn bỏ qua ćc đặc điểm mà cả hai chủng đều thiếu [1].   
2.3.2  Phƣơng pháp hiện đại  
  Giới thiệu
  Ngày nay, sự ph́t triển của ćc kỹ  thụt sinh học hiện đ̣i đã đưa việc phân
lọi, định danh vi sinh ṿt lên một bước ph́t triển mới. Phương ph́p hiện đ̣i trong
định danh vi sinh ṿt dựa trên ṿt liệu di truyền ć thể cho kết quả chính x́c trong
một thời gian nǵn. Tuy nhiên, phương ph́p phân lọi hiện đ̣i này đòi hỏi phải ć
trang thiết bị hiện đ̣i và h́a chất đ́t tiền [3].
  Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng ćc phân tử sinh học ć thể là
“tài liệu của lịch sử tiến h́a”, là “thước đo tiến h́a”.  
  Phân tử rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì trình
tự đọn D1/D2 26S rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được sử dụng phổ biến để xây
dựng cây ph́t sinh chủng loài)  là một công cụ hữu ích trong phân lọi và định danh
vi sinh ṿt. Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả ćc  sinh ṿt, ć chức năng
không đổi, phân tử rRNA 16S còn ć ưu điểm là ć nhiều bản sao trong tế bào, ć
tính bảo tồn cao nhưng vẫn ć những vùng trình tự kh́c biệt giữa ćc loài và trình
tự đặc trưng từng nh́m vi sinh ṿt; đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân lọi nhờ  
   
16
ć kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thụn tiện cho việc giải trình
tự [1].  
  Phương ph́p hiện đ̣i dùng để định danh vi sinh ṿt bên c̣nh việc dựa vào
trình tự rRNA, ćc trình tự rDNA (trình tự mã h́a cho rRNA) cũng thường được sử
dụng, vì DNA là ṿt liệu dễ thu nḥn và ć tính bền cao hơn RNA.
  Một số phương ph́p phân lọi dựa vào ṿt liệu di truyền đang được sử dụng
hiện nay:  
  Sử dụng mẫu d̀ kết hợp với phƣơng pháp lai  in-situ phát huỳnh quang
(Fluorescence in-situ Hybridazation - FISH)  
  Mẫu dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đọn ṃch đơn của acid
nucleic (DNA) được ǵn với một nhân tố nḥn biết là ph́ng x̣ hay chất ph́t huỳnh
quang, dùng để nḥn biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nḥn diện) của một
chủng vi sinh ṿt đã biết trước.
   Phân tích dữ liệu ćc trình tự SSU rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ cho
phép x́c định ćc trình tự nḥn diện chuyên biệt cho từng giới. Một số trình tự nḥn
diện cho một nh́m chuyên biệt chuyên biệt trong giới, tḥm chí một giống, một loài
cũng đã được x́c định. Trong tương lai, nhiều trình tự tương tự được x́c định và sẽ rất
hữu dụng trong việc nḥn diện, định danh một vi sinh ṿt mới.
  Ćc trình tự nḥn diện chuyên biệt cho vi khuẩn ć thể được tổng hợp, đ́nh
dấu bằng chất ph́t huỳnh quang và dùng để ph́t hiện chuyên biệt ćc giới này. Ćc
mẫu dò này được gọi là “mẫu dò ph́t sinh chủng lọi” (phylogenic prode).  
  Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh ṿt bằng một t́c nhân thích hợp làm tăng
tính thấm của màng, cho phép mẫu dò vào bên trong tế bào, thực hiện phương ph́p
lai phân tử (lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào mẫu), và quan śt dưới kính
hiển vi huỳnh quang, người ta ć thể x́c định trực tiếp chủng thuần thuộc giới nào
hay quần xã vi sinh ṿt hiện diện trong một mẫu tự nhiên gồm những giới nào. Kỹ
thụt lai và ph́t hiện này được gọi là phương ph́p lai in-situ huỳnh quang (FISH).
Phương ph́p này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh th́i học vi sinh ṿt.
 
   
17
  Phƣơng pháp lai nucleic acid [4]
  Thành phần base của DNA chỉ ć t́c dụng chứng minh ćc vi khuẩn là không
ć liên hệ với nhau. Tỷ lệ ćc base trong DNA ć thể thay đổi trong pḥm vi rất
rộng. Nếu hai vi sinh ṿt ć thành phần base kh́c nhau thì ch́ng không ć liên hệ
với nhau. Tuy nhiên, hai vi khuẩn ć cùng thành phần base chưa hẳn là ć quan hệ
với nhau do trình tự base ć thể kh́c nhau. Việc lai giữa ćc DNA của hai vi khuẩn
cho phép định danh một loài mới hoặc x́c định mối quan hệ đến mức giống và loài
giữa hai vi khuẩn.  
  Để x́c định mối quan hệ giữa ćc chủng, thông thường người ta so śnh phần
trăm lai (DNA-DNA) giữa chủng cần khảo śt với một chủng đã biết (chủng
chuẩn). DNA từ chủng chuẩn được ly trích, tinh chế, đ́nh dấu bằng đồng vị ph́ng
x̣, phân đọn thành những đọn nǵn ć chiều dài ngẫu nhiên, đun ńng để t́ch
ṃch. DNA từ ćc chủng được khảo śt cũng được chuẩn bị tương tự nhưng không
được đ́nh dấu. Tiến hành lai mẫu DNA chủng chuẩn với nhau (đối chứng). Sau đ́
tuần tự lai DNA chủng chuẩn với DNA chủng cần khảo śt. Thu lấy DNA ṃch kép
(ć lai), lọi bỏ DNA ṃch đơn. Đo năng lượng ph́ng x̣ của trường hợp đối
chứng. Lượng này được xem là tương đương 100% lai. Tương tự tính năng lượng
ph́ng x̣ thu được từ ćc trường hợp lai giữa chủng chuẩn với chủng được khảo śt.
Tính phần trăm lai.
  Từ số liệu về mức độ lai ć thể x́c định mối tương quan giữa ćc chủng như
sau:
-  Trên 70% lai: 2 chủng cùng loài (kh́c chủng)
-  Trên 20% lai: 2 chủng cùng giống (kh́c loài)
-  Dưới 10% lai: 2 chủng kh́c giống
  Lai nucleic acid dựa vào nguyên t́c bổ sung giữa ćc base A-T và G-C. Ćc
đọn polynuclotide đơn ć nguồn gốc kh́c nhau nhưng ć cấu tŕc bổ sung với
nhau thì ch́ng ć thể b́t cặp với nhau ṭo ra phân tử lai.
Một số phương ph́p lai nucleic acid thường được sử dụng:
-  Phương ph́p lai Southern Blot  
   
18
-  Kỹ thụt đa hình chiều dài ćc đọn ćt giới ḥn (Rectriction Fragment Length
polymorphism – RFLP) hay phương ph́p dấu vân tay (Finger Printing)
-  Phương ph́p lai Northern Blot
  Khuếch đại trình tự đặc hiệu nhờ phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain
Reaction) [12], [17]
  Trước khi giải trình tự đọn gen mong muốn, thì ta cần khuếch đ̣i ch́ng bằng
phương ph́p PCR. PCR là một phương ph́p  in vitro để tổng hợp DNA từ ṃch
khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đ̣i, nhân số lượng bản sao của
khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ họt động của enzyme polymerase và một
cặp mồi đặc hiệu cho đọn DNA này. Kỹ thụt này do Karl Mullis và ctv (Mỹ) ph́t
minh năm 1985. Hiện nay, kỹ thụt này được sử dụng rộng rãi để ph́t hiện, ṭo ra
ćc đột biến gen, chuẩn đón bệnh, ph́t hiện ćc mầm bệnh vi sinh ṿt ć trong
thực phẩm.
  Tất cả ćc DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một
ṃch DNA mới từ ṃch khuôn. Ṃch khuôn thường là một trình tự DNA của gen
(gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh ṿt mục tiêu hoặc gen quy
định việc tổng hợp một lọi độc tố chuyên biệt của vi sinh ṿt này. Mồi là những
đọn DNA nǵn, ć khả năng b́t cặp bổ sung với một đầu của ṃch khuôn và nhờ
họt động của DNA polymerase, đọn mồi này được nối dài để hình thành ṃch
mới. Khi ć sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt b́t cặp bổ sung với hai đầu của
một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo họt động của DNA
polymerase, đọn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đ̣i thành một số lượng
lớn bản sao đến mức ć thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethibium bromide.   
  Kỹ thụt PCR được coi là nền tảng của nhiều kỹ thụt phân tích DNA.  
  Giải trình tự các gen mã hóa cho tiểu phần rRNA 16S  
  Muốn nghhiên cứu trình tự ćc nucleotide của một gen, một đọn DNA, hoặc
cả phân đọn DNA cần phải tiến hành giải trình tự. Một số phương ph́p giải trình
tự thường dùng hiện nay:  
   
19
  Phƣơng pháp hóa học  (Phương pháp Maxam và Gilbert, 1977): Ćc đọn
DNA được đ́nh dấu bằng đồng vị ph́ng x̣ ở dầu 5’, và được xử lý bằng ćc chất
h́a học nhằm bẻ gãy ćc đọn DNA ṭi ćc vị trí ćc base kh́c nhau.
  Phƣơng pháp dideoxy  (Phương pháp Sanger,1977): dựa trên họt động của
enzyme DNA Polymerase x́c t́c phản ứng kéo dài chuỗi polynucleotide, và dừng
ḷi khi gặp ćc dideoxynucleotide (ddNTP).  
  Giải trình tự DNA  tự động: Dựa vào sự ph́t tín hiệu huỳnh quang từ những
dNTP được đ́nh dấu. Ngoài ra, gần đây hai kỹ thụt mới được thiết ḷp cũng được
sử dụng để định danh vi sinh ṿt dựa trên ṿt liệu di truyền là Ribotyping và FAME
(Fatty Acid Methyl Ester):
  Kỹ thuật Ribotyping  
Kỹ thụt này cũng phân tích SSU rRNA (nhưng không giải trình tự) gíp định danh
vi sinh ṿt đến mức loài, dựa trên sự sai kh́c trong trình tự nḥn diện của ćc
enzyme ćt giới ḥn. Gen mã h́a cho SSU rRNA được khuếch đ̣i bằng PCR, ćt
bằng một hoặc vài enzyme ćt giới ḥn, t́ch bằng điện di và lai bằng ćc mẫu dò.
Ćc ṿch lai là chuyên biệt cho từng loài và chủng vi sinh ṿt, được đưa vào cơ sở
dữ liệu và được sử dụng như là ćc mã ṿch để định danh vi sinh ṿt [].  
  Kỹ thuật Fame (Fatty Acid Methyl Ester)
Kỹ thụt này dựa trên tính chuyên biệt về chủng lọi và thành phần ćc acid béo
hiện diện trong màng tế bào vi khuẩn. Tính chuyên biệt này là do sự đa ḍng về
chiều dài ṃch, nh́m thế, vòng, hydroxyl, độ không bão hòa,…của acid béo trong
màng. Việc phân tích dẫn xuất methyl ester của ćc acid béo này ngày càng được
dùng rộng rãi trong chuẩn đón bệnh, dịch tễ học, xét nghiệm vi sinh ṿt trong
nước, thực phẩm… [4]

MỤC LỤC
 
CHƢƠNG.....................................................................................  ...............TRANG   
Trang tưa  ................................................................................................................... i
Lơi cam ơn ..............................................................................................................  iii
T́m t́t   .................................................................................................................. iv
Mục lục    ................................................................................................................... v
Danh sach cac chư viêt tăt  ..................................................................................... viii
Danh sach cac hinh   ................................................................................................. ix
Danh śch ćc sơ đồ và biểu đồ .............................................................................. xi
Danh sach cac bang  ................................................................................................ xii
 
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU  ............................................... 
1.1. Đặt vấn đề .......................................................... 
1.2. Mục tiêu ............................................................
1.3. Yêu cầu  ............................................................... 
Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU  ....................
2.1. Vườn Quốc gia Ćt Tiên   ...................................  .
2.2. Sơ lược sự tương t́c giữa vi sinh ṿt và thực ṿt   ...........
2.2.1 Phân nh́m vi sinh ṿt tương t́c với thực ṿt dựa vào bản chất của sự        
tương t́c..................................  ....................................................................................  7
2.2.1.1. Ćc vi sinh ṿt ức chế t́c ḥi của mầm bệnh lên thực ṿt............ ...... E
2.2.1.2. Vi sinh ṿt gia tăng dinh dưỡng cho cây   ..... 
2.2.2. Vi khuẩn sản xuất ćc chất kích thích lên sự sinh trưởng ở thực ṿt.  .....
2.3. Ćc phương ph́p định danh vi sinh ṿt  ............. 
2.3.1. Phương ph́p truyền thống  .............................. 
  vi
2.3.1. Phương ph́p hiện đ̣i  ...................................... 
  vii
Chƣơng 3: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP  ........... 
3.1. Thời gian và địa điểm  ......................................... .
3.2. Ṿt liệu  ............................................................... 
3.2.1. Mẫu thí nghiệm  ............................................... 
3.2.2. Thiết bị dụng cụ .............................................. 
3.2.3. H́a chất .......................................................... 
3.2.3.1. Môi trường phân ḷp và làm thuần vi sinh ṿt  biến dưỡng methyl
(MMS)………………..  ............................................. 
3.2.3.2. Môi trường chọn lọc vi sinh ṿt cố định nitơ (MSO) .
3.2.3.3. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS) 
3.2.3.4. Ćc môi trường kh́c  .................................... 
3.3. Phương ph́p thí nghiệm  .................................... 
3.3.1. Phân ḷp và làm thuần  .....................................
3.3.1.1. Lấy mẫu và tăng sinh mẫu:  ..........................
3.3.1.2. Phân ḷp chọn lọc  ......................................... 
3.3.1.3. Giữ giống
  ... ………………………………………………………………….
3.3.2. Định tính  .......................................................... 
3.3.2.1. Khảo śt khả năng kích thích sinh trưởng thực ṿt của ćc chủng kiện in
vitro và in vivo  ........................................................... 
3.3.2.2. Xử lý thống kê  ..............................................
3.3.2.3. Quan śt hình th́i  ......................................... 
3.3.3. Định danh vi khuẩn  ......................................... 
3.3.3.1. Khảo śt ćc đặc điểm hình th́i, sinh lý, sinh h́a  ....
3.3.3.2. Đặc điểm sinh lý  ........................................... 
3.3.3.3. Đặc điểm sinh h́a  ........................................  
  viii
3.3.3.4. So śnh tính tương đồng di truyền dựa trên hệ số  Jascard   .................
3.3.3.5. Phân tích trình tự rDNA 16S.  ....................... 
3.3.4. Định danh nấm men  ........................................ 
3.3.4.1. Khảo śt ćc đặc điểm hình th́i nấm men  ... 
3.3.4.2. X́c định một số đặc tính sinh h́a của nấm men  .......
 
Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN  .................. 
4.1. Kết quả phân ḷp và làm thuần  ...........................  .
4.2. Kết quả sàng lọc ćc chủng ć khả năng tương t́c với thực ṿt.  ..............
điều kiện in vitro .......................................................  .
4.2.2. Khảo śt khả năng kích thích sự nảy mầm của ḥt giống  ....
4.3. Định danh vi sinh ṿt ......................................... .
4.3.1. Kết quả quan śt hình th́i  ............................... 
4.3.2. Định danh vi vi khuẩn.................................................................................... 59
4.3.2.1. Kết quả khảo śt ćc đặc điểm hình th́i, sinh lý, sinh h́a......................... 59
4.3.2.2. Phân tích trình tự rDNA 16S .......................................................................70
4.3.3. Định danh nấm men .......................................................................................77
4.3.3.1. Quan śt ćc đặc điểm hình th́i nấm men ..................................................77
4.3.3.2. Ćc đặc điểm sinh lí, sinh h́a .....................................................................80
 
Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ .......................  Error! Bookmark not defined.2
5.1  Kết lụn ....................................................  Error! Bookmark not defined.2
5.2  Đề nghị  .......................................................  Error! Bookmark not defined.
 
  ix
TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………..  ………….85
 
PHỤ LỤC  
  viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
 
  Bp  Base pair
  EDTA  Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid
  MS   Murashige và Skoog, 1962
  CMS  Môi trường bổ sung 2% cao thịt và 2% casein
  MMS  môi trường Methanol Minerol Salts
  Gram (-)   Gram âm
  Gram (+)   Gram dương
  PPFM   Pink-Pigment Facultative Methylotrophic
  PCR    Polymerase chain reaction
  MSo  Môi trường khóng MS không ć nitrogen
  DNA  Deoxyribonucleotide Acid
  Taq  Tag polymerase   
  LDC  Lysine decarboxylase
  PHB   Poly-beta-hydroxybutyrate  
  ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
 
  TRANG
Hình 2.1: (A) Qú trình chuyển h́a hợp chất 1 carbon ở vi  
khuẩn biến dưỡng methyl; (B) Khuẩn ḷc Methylobacterium
từ cỏ ba ĺ trên môi trường phân ḷp   .......................................................................... 6
Hình 2.2: Phổ tương t́c cố định đ̣m trên thực ṿt  ................................................. 10
Hình 2.3: Azospirillum brasilense bề mặt của rễ ĺa  ............................................... 11
Hình 3.1: Chu trình nhiệt của ćc phản ứng PCR   .................................................... 41
Hình 4.1: Kết quả tương t́c của ćc chủng vi sinh ṿt lên  
chồi thuốc ĺ sau 2 tuần  ............................................................................................. 49
Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo ở chồi thuốc ĺ khi bổ sung  
chủng 6027a  .............................................................................................................. 49
Hình 4.3: Kết quả tương t́c của 2 chủng vi sinh ṿt ON16a (A),
ON29b (B) lên chồi thuốc ĺ  ..................................................................................... 52
Hình 4.4: Kết quả khảo śt khả năng kích thích nảy mầm của ch́ng  
6012a so với đối chứng sau 2 ngày.  .......................................................................... 55
Hình 4.5: Kết quả khảo śt khả năng kích ḥt nảy mầm của chủng  
ON20a so với đối chứng. .......................................................................................... 57
Hình 4.6: Hình th́i tế bào qua kính hiển vi ṿt kính 100X.  ..................................... 60
Hình 4.7: Khảo śt ngưỡng nhiệt độ ph́t triển của vi khuẩn  
6012a và vi khuẩn 6027a  ........................................................................................... 63
Hình 4.8: Kết quả thử nghiệm sinh h́a IDS 14GNR của hai chủng  
vi khuẩn.  .................................................................................................................... 66
Hình 4.9: Kết khảo śt khả năng cố định nitơ của hai chủng 6012a  
và 6027a. ................................................................................................................... 67
Hình 4.10: Kết quả định tính PHB của chủng 6012a dưới kính hiển
vi huỳnh quang bươc śng 460nm.  ............................................................................. 68
Hình 4.11: DNA bộ gen của ćc chủng vi khuẩn.  ..................................................... 71  
  x
Hình 4.12: Sản phẩm PCR với cặp mồi (2F, 2R).  ..................................................... 72
Hình 4.13: Sản phẩm PCR với cặp mồi (27F, 1525R).............................................. 73
Hình 4.14: Sản phẩm PCR với cặp mồi (520F, 920R).............................................. 74
Hình 4.15: Mối quan hệ ph́t sinh loài của chủng 6012a với tất cả
ćc chủng chuẩn của ćc loài Methylobacterium đã và sẽ công  
bố trong năm 2007 dựa trên trình tự rDNA 16S nguyên vẹn ................................... 76
 
  xi
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ
 
TRANG
Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm  ............................................................................  24
Biểu đồ 4.1: So śnh ảnh hưởng của ćc chủng vi sinh ṿt lên  
chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc ĺ trên môi trường MS  ................................... 47
Biểu đồ 4.2:  So śnh ảnh hưởng của ćc chủng vi sinh ṿt lên trọng  
lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc ĺ trên môi trường MS  .......................... 48
Biểu đồ 4.3: So śnh ảnh hưởng của vi sinh ṿt lên chiều cao và
 chiều dài rễ cây thuốc ĺ trên môi trường MSo  ..................................................... 51
Biểu đồ 4.4: So śnh ảnh hưởng của vi sinh ṿt lên trọng lượng tươi và  
trọng lượng khô cây thuốc ĺ trên môi trường MSo .............................................. 51
Đồ thị 4.1: Đường tương quan tuyến tính giữa gí trị OD610nm và
ṃt độ tế bào  .......................................................................................................... 61
Đồ thị 4.2: Đường cong tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn phân ḷp được  ........... 61
Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai  
chủng vi khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy  ..................... 62
Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi  
khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy  .................................... 62
  xii   
DANH MỤC CÁC BẢNG
 
TRANG
Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm
 sinh h́a IDS 14GNR ............................................................................................... 37
Bảng 4.1: Khảo śt khả năng tương t́c thực ṿt của ćc chủng vi sinh  
ṿt biến dưỡng methyl trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962)  ............... 47
Bảng 4.2: Kết quả khảo śt khả năng kích thích sinh trưởng của ćc chủng              
vi sinh ṿt trên chồi thuốc ĺ nuôi cấy in vitro trong môi trường MSo .................... 50
Bảng 4.3: Kết quả khảo śt khả năng kích thích nảy mầm của ćc chủng                 
vi sinh ṿt biến dưỡng methyl  ................................................................................... 53
Bảng 4.4: Kết quả khảo śt khả năng kích thích nảy mầm của ćc
chủng vi sinh ṿt phân ḷp trên môi trường MSo  ...................................................... 55
Bảng 4.5: Bảng thống kê ćc đặc điểm hình th́i của ćc chủng  
vi sinh ṿt ć khả năng tương t́c với thực ṿt ......................................................... 58
Bảng 4.6: Ćc đặc điểm hình th́i cơ bản của 2 chủng vi khuẩn   ............................. 60
Bảng 4.7: Đặc điểm biến dưỡng carbon của hai chủng 6012a và 6027a  .................. 64
Bảng 4.8: Bảng kết quả thử nghiệm sinh h́a IDS 14GNR và  
họt tính Catalase……………………………………………………………………66
Bảng 4.9: Bảng tổng kết ćc đặc điểm hình th́i sinh lý sinh h́a
của 2 chủng vi khuẩn  ................................................................................................. 69
Bảng 4.10: Nồng độ và độ tinh ṣch DNA bộ gen của chủng  
phân ḷp được ghi nḥn qua ḿy đo Nanodrop ........................................................ 71
Bảng 4.11: Hệ số tương đồng di truyến của chủng 6012a với ćc loài
Methylobacterium sp. đã được công bố  .................................................................... 75
Bảng 4.11: Đặc điểm hình th́i của ćc chủng nấm men  .......................................... 78
Bảng 4.12: Khả năng lên men đường glucose .......................................................... 80
Bảng 4.13: Khả năng đồng h́a nguồn carbon và đồng h́a nitrat  ............................ 80
 
 
Đánh giá : 
0
X
Hãy điền tên đăng nhập ở Nông nghiệp hữu cơ của bạn.
Điền mật khẩu đi kèm với tên đăng nhập.
Đang nạp