Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú

biotechvn
Số bài viết:
447
Số tài liệu đã gửi:
288
Ngày đăng:
08-06-2012
Ngày cập nhật:
28-11-2012 | 00:57:35
Thể loại:
Luận văn - Luận án
Chuyên ngành:
Công nghệ protein
Số lần xem:
2 654
Số bình luận:
1
Ngôn ngữ tập tin:
Tiếng Việt
Bạn phải Đăng nhập để tải tập tin
Hình thức chia sẻ: 
Đường dẫn
Mô tả tài liệu: 
Để hiểu biết về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có những biện pháp bảo quản hữu hiệu trong chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm để thu chế phẩm protease.  
  Đề tài tiến hành khảo sát khả năng tách chiết protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm của dung môi: nước cất, nước muối sinh lý, đệm phosphate và Tris-HCl với các tỷ lệ khác nhau. Chọn ra dung môi với tỷ lệ chiết thích hợp thu DC; Khảo sát khả
năng tủa của các tác nhân: cồn ethylic, acetone và muối sulfate amon với các nồng độ (tỷ lệ) khác nhau. Chọn tác nhân tủa với nồng độ (tỷ lệ) thích hợp  tủa DC thu CPT; Khảo sát các tính chất tối ưu cho hoạt động protease CPT của mẫu nội tạng từ
tác nhân tủa tốt nhất; Tinh sạch  protease CPT của các tác nhân  tủa với nồng độ thích hợp từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp, Bio-Gel P 100. Xác định trọng lượng phân tử protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật điện di
SDS-PAGE.
   Kết quả thí nghiệm: dung môi tách chiết  Tris-HCl với tỷ lệ mẫu/dd Tris- HCl =1/7 (w/v); Tác nhân tủa cồn với tỷ lệ DC/dd cồn = 1/6 (v/v); Protease CPT tủa cồn của mẫu nội tạng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 47o C, pH 7,0, nồng độ muối ăn 3%. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy enzyme sau tinh sạch có trọng lượng phân tử nằm  trong khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da.
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
  Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến nay. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận lớn cho nhiều nước, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế gới tăng 20-30% mỗi năm. Việt Nam là nước có nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Trong đó protease là enzyme  thủy phân có giá trị thương mại rất lớn. Nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm đặc biệt trong y học hiện đại. Chính vì thế đã có nhiều nghiên cứu tách chiết thu nhận protease từ nhiều nguồn gốc khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vât.
Gần đây, do những nhu cầu về vệ sinh, an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng và do đó, chế phẩm protease  từ vi sinh vật ngày càng cao. Trong khi đó, chế phẩm protease thu nhận từ thực vật và mô động vật
luôn được coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương mại.  
  Tôm là loại động vật thuỷ sinh đang đứng đầu trong ngành nuôi trồng thuỷ sản. Với mức đóng góp 70  - 80% giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản nên hiện nay tôm là mặt hàng  chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm đông lạnh. Tôm là thực phẩm  có giá trị dinh dưỡng cao (chứa 21,04% protein  – nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng về tôm sú) nên nó là mặt hàng rất được ưa chuộng trên thị trường quốc tế. Tôm dùng cho chế biến được cung cấp từ hai nguồn: đánh bắt và nuôi trồng, trong đó nguồn tôm nuôi đang chiếm ưu thế và nuôi tôm ở Việt Nam trong những năm gần đây đã trở thành ngành kinh tế quan trọng. Các sản phẩm chế biến tôm chủ yếu là tôm bỏ vỏ, bỏ đầu, tôm bỏ đầu bóc vỏ còn đuôi, tôm 2 thịt xẻ lưng … Trong quá trình gia công chế biến tôm thường loại  ra các phế phụ phẩm như nội tạng, đầu và vỏ  tôm. Phế phụ phẩm này của tôm  là nguồn thu nhận protease cao, mang lại lợi nhuận lớn cho công nghiệp sản xuất enzyme.
  Để hiểu về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có biện pháp hữu hiệu trong bảo quản, chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và  tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm cho việc thu nhận protease  chúng  tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú”.
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
  Mục đích chung của đề tài là tách chiết và tinh sạch protease từ nội tạng và đầu của tôm sú cũng như tính chất của nó. Để đạt điều này, đề tài tập trung vào các nội dung cụ thể sau:
  Xác định quy trình tách chiết protease từ nội tạng và đầu của tôm sú
  Xác định tỷ lệ dung môi tách chiết protease thích hợp.
  Xác định loại dung môi tách chiết protease thích hợp.
  Xác định nồng độ tác nhân tủa thu hồi protein.
  Xác định tác nhân tủa thu hồi protein.
  Nghiên cứu  các  yếu tố ảnh hưởng  đến hoạt động protease của chế phẩm enzyme.
  Khảo sát hoạt tính theo pH.
  Khảo sát hoạt tính theo nhiệt độ.
  Xác định độ bền của protease.
  Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.
  Xác định trọng lượng phân tử của protease bằng điện di protein.
Chương 2  
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME
2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme
  Khi con người chưa có khái niệm về enzyme là gì nhưng con người đã biết sử dụng nó trong chế biến bảo quản thực phẩm lên men cổ truyền. Khoảng 5.000 năm trước công nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương chao,…  ở các mức độ khác nhau, là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại.
Những mốc thời gian quan trọng trong nghiên cứu và phát triển môn enzyme học
  Năm 1833, Payen và Persoz tách được diatase từ malt.
  Năm 1874, Hansen là người đầu tiên tách được renet từ bao tử cừu.
  Năm 1876, Kihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme.
  Năm 1897, hai anh em Buchner chứng minh dịch từ nấm men có thể chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO2.
  Năm 1913, Rohm là người đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa.
  Năm 1917, Boidin và Effront nghiên cứu α.amylase của B.Subtilis  và ứng dụng trong ngành dệt.
  Năm 1920-1928, Will Slitter tinh sạch được enzyme.
  Năm 1926, Samner kết tinh được urease; Northrop kết tinh được protease.
  Năm 1928, Fleming phát hiện ra penicilline.
  Từ thế chiến thứ hai, bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp, sử dụng amyloglusosidase đường hóa tinh bột. Sử dụng  penicillineacylase trong sản xuất penicilline.
  Năm 1972, Boyer và các cộng sự đưa ra kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật này có tác động tích cực cho công nghệ enzyme.
  Năm 1984, Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acry-lamide và một loạt các quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme.
2.1.2. Định nghĩa về enzyme
  Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hoá cao có vai trò và chức năng sinh học quan trọng bậc nhất đối với tế bào và cơ thể sống. Enzyme có khả năng xúc tác với tốc độ đặc hiệu cơ chất vô cùng hoàn hảo, xúc tác đặc hiệu các phản ứng hoá học ở điều kiện bình thường mà các chất xúc tác hoá học khác không thể thực hiện nổi. Enzyme tham gia xúc tác tất cả các phản ứng biến đổi trong tế bào và cơ thể sống. Trong đó nhiều enzyme đóng vai trò điều hoà chủ đạo trong việc điều khiển sự phối hợp nhịp nhàng các phản ứng của quá trình trao đổi chất.
  Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hoá học rất khó xảy ra trong các điều kiện bình thường ở ngoài cơ thể (để tiến hành cần có nhiệt độ cao, áp suất cao, môi trường acid mạnh hay kiềm mạnh...) nhưng trong cơ thể, nó xảy ra hết
sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức “êm dịu nhẹ nhàng” nhiệt độ 37o C, áp suất thường, môi trường trung tính, ở nồng độ cao…
  Cơ thể thiếu enzyme thì mọi quá trình chuyển hoá sẽ đình trệ, các hoạt động sống, sinh sản, phát triển của của cơ thể sống không được bình thường.
  Tóm lại: enzyme là protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hoá sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác.
2.1.3. Cấu tạo phân tử
  Enzyme có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn ở nhiệt độ thường và có tính đặc hiệu rất cao cho nên cấu tạo phân tử của enzyme rất tinh vi và phức tạp. Enzyme có bản chất protein, phân tử lượng lớn thường là 10.000 đến 1.000.000 Datol. Ví dụ phân tử lượng của ribonuclease là 12.000 Da, glutamt dehydrogenase là 1.000.000 Da, urease là 483.000 Da; đa số enzyem có hình dạng phân tử thuộc loại protein hình  cầu. Có loại enzyme đơn nguyên nhưng cũng có loại enzyme đa nguyên do nhiều đơn vị nhỏ tạo nên, mỗi đơn vị nhỏ là một chuỗi poplypeptit. Dung dịch enzyme có tính chất dung dịch keo. Enzyme không bền với nhiệt, ở nhiệt độ cao enzyme mất hoạt tính xúc tác. Các yếu tố gây biến tính protein như acid hay kiềm, muối kim loại nặng làm cho enzyme mất hoạt tính.
  Thành phần cấu tạo của enzyme
  Enzyme có thể chia hai loại theo cấu tạo hoá học: Enzyme đơn giản và enzyme phức tạp. Loại đơn giản chỉ là những phân tử protein đơn thuần, sản phẩm thuỷ phân chỉ gồm các acid amin. Enzyme phức tạp ngoài phần protein còn có phần khác không phải protein apoenzyme thể hiện tính chất cơ bản của enzyme và tính đặc hiệu của nó. Phần không phải protein được gọi là coenzyme, còn gọi là nhóm ngoại thường có chứa vitamin, phần này chung cho nhiều enzyme, trong quá trình xúc tác thì biến đổi. Trong thành phần cấu tạo của nhiều enzyme có chứa kim loại.
  Trung tâm hoạt động của enzyme
  Mỗi hoạt động xúc tác của enzyme đều thông qua bộ phận đặc biệt của phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trung tâm này gồm những nhóm hoá học, những liên kết peptit tiếp xúc trực tiếp với cơ chất. Một phần hoặc toàn bộ
phân tử enzyme được coi là có khung cấu trúc thích hợp để duy trì hình dạng cần thiết đối với tính chất đặc hiệu và hiệu lực xúc tác. Do vậy khi làm  thay đổi hình dạng của chúng dẫn đến khả  năng xúc tác bị thay đổi. Trung tâm hoạt động của enzyme thường bao gồm những acid amin có nhóm hoá học có hoạt tính cao như serin (-OH), histidin (vòng inmidozol), cytein (-SH), lysin (-NH3), tryptophan (indol), glutamic (-COOH). Các gốc acid amin tạo nên trung tâm hoạt động không nhất thiết sắp xếp ở cạnh nhau trong cấu trúc bậc 1 nhưng gần nhau trong cấu trúc bậc 2, 3 và 4.  6
2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại
  Danh pháp: theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên một enzyme thường có hai phần.
  Phần đầu là tên cơ chất. Trong trường hợp phản ứng đó  là phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của hai cơ chất viết cách nhau hai chấm.  
  Phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng.
Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme vì thói quen nên vẫn được gọi theo tên cũ, không theo hệ thống phân loại. Ví dụ như trypsin, chimotrypsin, pepsin…
  Phân loại
Hội nghị sinh hoá quốc tế lần thứ V (1962) chia enzyme làm 6 loại ký hiệu E.C.
1.  Oxydoreductase là men  ......... Oxy hoá khử.
2.  Transferase  ............................  Vận chuyển nhóm.
3.  Hydrolase  .............................. Thuỷ phân.
4.  Lyase  ..................................... Phân cắt.
5.  Isomerase .............................. Đồng phân.
6.  Ligase  .................................... Tổng hợp.
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme
  Nồng độ cơ chất
  Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc nồng độ cơ chất. Nồng độ cơ chất tăng độ phản ứng xúc tác của enzyme tăng, nhưng khi nồng độ cơ chất tăng đến mức cao thì tốc độ phản ứng đạt đến cực đại không tăng nữa. Thời điểm này enzyme bão hoà
cơ chất.
  Nồng độ enzyme
  Tốc độ phản ứng xúc tác bởi enzyme tỷ  lệ thuận với hàm lượng enzyme nhưng khi tăng cao nồng độ enzyme thì tốc độ cũng không tăng nữa do các sản phẩm được tạo ra nhiều sẽ tác dụng vào vị trí dị lập thể của enzyme làm cho phản ứng đạt ở mức độ bão hoà.  
  Tác dụng của nhiệt độ
  Nhiệt độ có tác dụng làm tăng  tốc độ của phản ứng enzyme lên đến tốc độ cực đại đến chừng nào enzyme chưa bị biến tính, mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10o C tốc độ phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần. Khi nhiệt độ tăng đến khoảng 60 – 70o C thì phần lớn các enzyme mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tới hạn.
  Mỗi enzyme yêu cầu một nhiệt độ xúc tác tối ưu riêng ở nhiệt độ này enzyme đạt tốc độ cao nhất. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp của enzyme gần với nhiệt độ của cơ thể vào khoảng 40o C. Ở các vi sinh vật chịu nhiệt độ cao, enzyme của chúng có
nhiệt độ thích hợp, ví dụ amylase động vật có nhiệt độ cao, enzyme ứng dụng khoảng 45 – 50o C nhưng    - amylase của vi sinh vật chịu nhiệt có nhiệt độ thích hợp là 70o C, đối với các enzyme của các vi sinh vật cảm ứng sống trong các suối nước nóng thì nhiệt độ thích hợp vào khoảng gần nhiệt độ sôi của  nước. Nhiều enzyme thực vật có nhiệt độ thích hợp khá cao như papain ở 80o C vẫn còn khả năng hoạt động.
  Tác dụng của pH
  Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường; nó ảnh hưởng rất lớn đối với tốc độ của phản ứng enzyme. Mỗi enzyme có một giá trị pH cho hoạt động của mình. Rất nhiều enzyme có pH thích hợp ở vùng trung tính nhưng có enzyme hoạt động tốt ở vùng acid hay ở vùng kiềm. pH ảnh hưởng đối với các phản ứng của enzyme do nhiều tác dụng rất khác nhau do pH tác dụng vào trạng thái ion hoá của phân tử enzyme nhất là do các nhóm hoạt động của enzyme, vào trạng thái ion hoá của cơ chất, vào độ bền vững của phân tử enzyme và ảnh hưởng đến sự kết hợp giữa phần protein và phần phụ không phải protein. Đối với enzyme có những nhóm hoạt động đặc biệt có thể tồn tại dưới nhiều dạng ion khác nhau và thường chỉ ở một trạng thái có tác dụng xúc tác. pH có tác dụng quyết định đối với trạng thái ion hoá của phân tử enzyme nói chung và các nhóm hoạt động của enzyme nói riêng, nên ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.
  Tác dụng của ion kim loại
  Sự có mặt hay vắng mặt ion kim loại không thể hiện rõ đối với một số enzyme nhưng nhiều enzyme chịu ảnh hưởng sâu sắc đến nồng độ và bản chất của ion kim loại. Có một số ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động một số enzyme; nhưng cũng có những ion kim loại như Ag+ , Hg+ , Pb+  có độc tính cao với hầu hết các enzyme. Một số ion kim loại ức chế enzyme này nhưng hoạt hóa enzyme kia. Có những  ion kim loại ức chế một enzyme ở nồng độ này nhưng lại hoạt hoá chính enzyme đó ở nồng độ khác. Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn tác dụng với cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzyme.
  Tác dụng của chất hoạt hoá
  Chất hoạt hoá có kha  năng làm tăng tác dụng xúc tác của enzyme. Chất hoạt hóa thường có bản chất rất khác nhau. Ví dụ các amino nhóm halogen như Cl-, Br-,I- có tác dụng hoạt hoá   - amylase. Glutathion có tác dụng hoạt hoá nhiều protease
thực vật, một số enzyme oxy hoá khử có nhóm hoạt động  – SH. Cystein là acid amin hoạt hoá nhiều men có nhóm  –  SH  hoạt động. Tác dụng hoạt hoá của glutathion, cystein là do khả năng khử liên kết disulfur của phân tử enzyme. Các enzyme nhóm – SH hoạt động thường chỉ hoạt động được khi các nhóm này ở dạng khử. Nhiều ion kim loại cũng có tác dụng hoạt hoá enzyme.
  Chất ức chế
  Là những chất làm giảm tốc độ xúc tác của enzyme. Chất ức chế có thể gây ra quá trình ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh và ức chế trên phức hợp enzyme cơ chất.
2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ  PROTEASE CỦA TÔM
2.2.1. Giới thiệu về tôm  
  Tôm sú còn gọi là tôm cỏ, tôm nương, tôm sú rằn, thuộc lớp giáp xác, bộ mười chân, họ tôm he, giống tôm he, loài tôm sú, có tên khoa học là  Penaeus monodon, tên thương mại là Black Tiger Shrimp. Tôm sú được đánh  bắt và nuôi trồng hàng đầu thế giới. Theo thống kê của tổ chức Lương thực Nông nghiệp thế giới (Food Agriculture Organization  -  FAO), sản lượng tôm sú năm 1997 chiếm 52% sản lượng tôm nuôi trồng toàn thế giới, với tốc độ tăng trưởng trung bình 2%/năm. Trong các vùng nuôi tôm chủ yếu trên thế giới, Ðông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng tôm toàn thế giới trong tổng số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển (thống kê của FAO năm 1997).
Hiện nay, ở Việt Nam tôm sú là một trong 5 loại tôm được nuôi trồng phổ biến và quan trọng nhất đối với nền kinh tế Việt Nam
  Tôm sú (Black tiger shrimp) - Penaeus monodon.
  Tôm thẻ (Banana shrimp) - Penaeus merguiensis.
  Tôm chân trắng (White leg shrimp) - Penaeus vannamei.
  Tôm Nhật Bản (Kuruma shrimp) - Penaeus japonicus.
  Tôm càng xanh (Giant fresh water prawn).
Nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây, trở thành ngành kinh tế quan trọng. Năm 2002, giá trị xuất khẩu thủy sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 47%. Năm 2004, xuất khẩu thủy sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nước trong đó tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản. Hiện nay, tôm sú vẫn là đối tượng chủ lực, thu hút sự chú ý lớn của người dân và chính quyền và cung cấp trong chuyển dịch cơ cấu kinh tế ven biển.    
2.2.2. Khái quát protease
2.2.2.1. Định nghĩa protease
  Protease là những esterase thủy phân protein, chúng  xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và  cắt liên kết peptid giữa các L-acid  amin thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton. Và chúng thường tác động lên các liên kết ester đơn giản.
  Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm
  Protease nội bào.
  Protease ngoại bào.
  Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất
  Endopeptidase: enzyme thủy phân peptid ở giữa mạch.
  Exopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch.
  Dựa vào pH hoạt động
  Protease acid tính.
  Protease kiềm tính.
  Protease trung tính.
  Dựa vào nguồn thu nhận enzyme
  Protease động vật.
  Protease thực vật.
  Protease vi sinh vật.
  Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme
  Serine protease (OH): trypsine, chymotrypsine, substilopeptidase, milk alkaline protease (MAP), Thrombin…
  Thiol protease (SH): papain, bromeline…
  Aspartic protease (COOH): pepsin, renin…
  Metallo protease: carboxylpeptidase A, collagenase (cần trung tâm hoạt động là Zn2+  hoặc Mg2+ ).
2.2.2.2. Protease của tôm
  Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều. Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác với động vật có xương sống. Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá. Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao. Ngoài ra, còn có  enzyme chymotrypsin, astacine, collagenase…  
  Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt. Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác.
  Có nhiều cách phân loại protease, tuỳ vào khả năng thuỷ phân khác nhau mà các protease có đặc tính khác nhau. Nhóm enzyme này có tác dụng thuỷ phân protien, có tính đặc hiệu rộng rãi, chúng không chỉ thuỷ phân liên kết peptid mà còn có thể thuỷ phân các liên kết ester và cũng có thể xúc tác cho chuyển về gốc acid amin. Tuy nhiên, mức độ tác dụng khác nhau.
  Phần lớn các nhóm enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung của một enzyme:
  Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính này để tách chiết chúng.   
  Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme.
  Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt hóa hay ức chế.
  Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ, pH môi trường.
  Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu cùng cộng tác viên về protease đầu tôm biển và Th.s Nguyễn Thị Mỹ Trang về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các enzyme tiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong môi trường kiềm. Theo Nguyễn Việt Dũng thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở môi trường gần trung tính.  
  Khả năng hoạt động của các enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo loài.
Chuang (1985) nhận thấy khả năng hoạt động của protease thô được xác định như khả năng hoạt động phân giải casein ở tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) và tôm đất (Metapenaecus ensis)  thấp hơn ở  Penaeus pencillatus,  Penaeus
monodon và Penaeus japonnicus.
2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nước và ngoài nước
a). Nghiên cứu trong nước
  Ở nước ta hiện nay, công bố nhiều công trình nghiên cứu protease. Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch và ứng dụng của enzyme các lĩnh vực công nghê thực phẩm và mỹ phẩm, dược phẩm.
  Nguyễn Liêu Ba  và Lê Văn Nhương (2001), nghiên cứu thu nhận và tinh sạch protease kiềm từ dịch nuôi cấy B.brevis B1.
  Lê Đức Mạnh và  các cộng sự  (1996) nghiên cứu thu nhận và bảo quản protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis.
  Phan Thị Hồng Hải và các cộng sự  (2001), nghiên cứu tinh chế protease từ sáng lá gan (Fasciolagigatica).
  Đỗ Văn Ninh (2004), tối ưu hóa quá trình phân giải protein của protease trong thị cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân.
  Vũ Văn Bội (2004), nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng protease từ Bacillus subtilis S5.
b). Nghiên cứu ngoài nước
  Corvisat (1857) chiết tách trypsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu nhận nhưng chưa tinh sạch.
  Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp phụ. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng như protein. Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách được Chymosin. Wurtz (1879) chiết tách được papain, Crassman và Ambros (1926) chiết tách được bromelain…  
  Theo Salem và các cộng sự (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0.3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ  lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark). Kết quả cho thấy với 0.3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%.  
  Liang và các cộng sự (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trà trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên.
  Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác.
  Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao.
2.2.3. Ứng dụng của protease
  Các protease nói chung  được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
  Trong công nghiệp:
  Trong sản xuất nước chấm : Nước mắm, tương, chao,…
  Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi chế biến,…
  Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…
  Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.  
  Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.  
  Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.  
  Trong nông nghiệp :  
Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
  Trong mỹ phẩm :  
Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già.
  Trong y học :
  Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch.
  Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu… bị sơ cứng. Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch…
  Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng.
  Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị tiêu hóa kém…
  Trong kỹ nghệ phim ảnh :  
Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý.
2.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH  ENZYME TRONG
NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme.
  Emzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại trong tế bào. Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển qua màng tế bào. Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp. Các phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử dụng để phá vỡ tế bào như:
  Phương pháp cơ học. Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa…
  Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm.
  Phương pháp hóa học  như dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate.
Quá trình trích ly enzyme từ nội tạng và đầu tôm sú chịu tác động của các yếu tố: tỷ lệ dung môi trích, nhiệt độ, thời gian, pH.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease
  Tỷ lệ dung môi với mẫu: mẫu mô động vật có nhiều thành phần khác nhau, ngoài protein của enzyme và các thành phần enzyme khác đặc biệt là hàm lượng lipit nhiều, ảnh hưởng đến quá trình trích ly, ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích ly được những
protein - protease ra ngoài mô nhiều hơn.
  Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết  protease động vật rất dễ biết tính hay giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ, hay ở nhiệt độ thích hợp enzyme hoạt động mạnh thủy phân protein lẫn nhau. Thường nhiệt độ ly trích protease từ mô động vật ở nhiềt độ không quá 5o C.
  Thời gian trích ly: đối với protease từ nguồn động vật dễ bị phân hủy vì hoạt tính protease mạnh và có sự hỗ trợ của các enzyme thủy phân khác có trong mô mẫu khi đê  ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn thì quá trình hòa tan của enzyme từ
mô tế bào mẫu. Chính vì vậy thời gian trích ly enzyme từ mô mẫu cần phụ thuộc loại mô mẫu và dung môi trích.
  pH là yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trong quá trình ly trích, có những enzyme acid thì cần phải trích ly ở pH acid  thì thu protein của enzyme đó cao hơn, còn enzyme kiềm thì ngược lại.  
2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme
  Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp sau
  Phương pháp gây biến tính chọn lọc
Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và bền nhiệt. Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70o C và pH ≤ 5. Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính. Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn.
  Phương pháp kết tủa phân đoạn
Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở  nồng độ muối khác nhau,  thường sử dụng muôi  (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, người ta được một số protein tạp ở giai  đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4  ra,  còn  có thể  sử dụng một số dung môi hữu cơ như ethanol, acetone để kết tủa protein.
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN  .......................................................................................................... IV
TÓM TẮT KHÓA LUẬN .......................................................................................  V
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT  ............................................................................ IX
DANH SÁCH CÁC BẢNG  ......................................................................................  X
DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ  ........................................................................ XI
Chương 1. MỞ ĐẦU  .................................................................................................  1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ  ..................................................................................................  1
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI  ...........................  2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................  3
2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME .............................................................  3
2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme  ..............................................  3
2.1.2. Định nghĩa về enzyme  ...............................................................................  4
2.1.3. Cấu tạo phân tử  .........................................................................................  4
2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại  ...............................................................  6
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme ..........................................  6
2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ  PROTEASE CỦA TÔM ...............................  8
2.2.1. Giới thiệu về tôm  .......................................................................................  8
2.2.2. Khái quát protease  ..................................................................................  10
2.2.2.1. Định nghĩa protease .........................................................................  10
2.2.2.2. Protease của tôm ..............................................................................  11
2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nước và ngoài nước ..............  12
a). Nghiên cứu trong nước ........................................................................  12
b). Nghiên cứu ngoài nước  ........................................................................  13
2.2.3. Ứng dụng của protease  ...........................................................................  14
2.3. PHưƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU..............  15
2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme.  .................................................................  15
2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme  ...............................................................  16
2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel ...................................................  18
2.3.3.1. Bản chất của phương pháp  ...............................................................  18
2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel  ..................................................................  20
a). Chọn lựa gel  .........................................................................................  20
b). Chuẩn bị gel và bảo quản  .....................................................................  20
2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu ...............................................................  20
a). Dựng cột lọc gel  ...................................................................................  20
b). Chuẩn bị mẫu  .......................................................................................  21
2.3.3.4. Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel  ......................................  21
2.3.3.5. ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel  ..............................................  22
a). Ưu điểm  ................................................................................................  22
b). Nhược điểm .........................................................................................  22
2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LưỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE .....  22
2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME  .....  24
2.5.1. Phương pháp Biuret  ................................................................................  24
2.5.2. Phương pháp Lowry  ................................................................................  25
2.5.3. Phương pháp Bradford  ...........................................................................  25
2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985)  ....................................  26
2.5.5. Phương pháp đo phổ  ...............................................................................  26
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  ............................  27
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM  ..........................................................................  27
3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU  .............................  27
3.2.1. Vật liệu  ....................................................................................................  27
3.2.2. Hóa chất  ..................................................................................................  28
3.2.3. Thiết bị ....................................................................................................  28
3.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG  ....................................  29
3.4. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................  29
3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú  .......................  29
3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease  ..................................................................  29
3.4.3. Bố trí thí nghiệm......................................................................................  30
3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp  ...  31
3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC ..........  32
3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của CPT  .....  33
a). Nhiệt độ  ................................................................................................  33
b). pH  .........................................................................................................  33
c). Nồng độ muối ăn  ..................................................................................  34
3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.....................................................  35
3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE  ..  35
3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................  35
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................  36
4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME ...................  36
4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau  .........  36
4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác nhau  ......  38
4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác nhau  ...  39
4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác nhau  ...  41
4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp  .......................  42
4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC ...................  44
4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau ...........................  44
4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau...............  46
4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau  ...  47
4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân ...................................  49
4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HưỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CPT  ......  51
4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú  .....  51
4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú  .....  52
4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú  ..  53
4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG  SẮC KÝ LỌC GEL  ........................  55
4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LưỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE  ..............  59
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  ..................................................................  64
5.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................  64
5.2. ĐỀ NGHỊ  ........................................................................................................  65
TÀI LIỆU THAM KHẢO  ......................................................................................  66
PHỤ LỤC  ...................................................................................................................  1
Phụ lục chương 3  .................................................................................................... 69
1.  Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford  ..........................  1
2.  Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano ............................  3
3. Phương pháp sắc ký lọc gel  ............................................................................  7
4. Điện di SDS-PAGE .........................................................................................  9
a). Chuẩn bị hộp điện di  ..............................................................................  9
b). Chuẩn bị mẫu protein  ...........................................................................  10
c). Đưa mẫu vào các giếng  ........................................................................  10
Phụ lục chương 4  .................................................................................................... 80
Đánh giá : 
0

Bình luận

cảm ơn nhiề nha!

Facebook Comments Box

X
Hãy điền tên đăng nhập ở Công nghệ sinh học Việt Nam của bạn.
Điền mật khẩu đi kèm với tên đăng nhập.
Đang nạp