Tinh sạch enzyme bromelain từ thân dứa (Ananas comosus (L.) Merr.) bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion

biotechvn
Số bài viết:
447
Số tài liệu đã gửi:
288
Ngày đăng:
09-06-2012
Ngày cập nhật:
26-11-2012 | 21:48:24
Thể loại:
Luận văn - Luận án
Chuyên ngành:
Công nghệ protein
Số lần xem:
2 398
Số bình luận:
0
Ngôn ngữ tập tin:
Tiếng Việt
Bạn phải Đăng nhập để tải tập tin
Hình thức chia sẻ: 
Đường dẫn
Mô tả tài liệu: 
Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromelaceae, đặc
biệt  là từ thân  (EC 3.4.22.32)  và trái dứa  (EC 3.4.22.33). Ở mỗi bộ phận khác
nhau thì bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.
Bromelain  có  trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả.
Bromelain  là nhóm endoprotease  có khả năng phân cắt các liên kết peptide  nội
phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi  là các peptide
(Dương Thị Hương Giang, 2005). 
2.4.3. Tính chất hóa học
2.4.3.1. Cấu tạo hóa học
Bromelain  thân là glycoproteinbase gồm phần protein và phần phi
protein. Phần phi protein là  một  glucide, ở mỗi phân tử gồm 3  manose, 1
xylose, 1 fructose và 2 glucosamine. Glucosamine  là phần nối trực tiếp với
mạch polipeptide  của phần protein. Sợi  hydrate  carbon liên kết hoán vị với
polypeptide. Trong sợi hydrate carbon này dường như một nửa sợi không liên
quan đến cơ chế xúc tác của phân tử.
Cấu trúc phần hydrate carbon của bromelain thân (Yasuda và ctv,1970):
Tùy từng phương pháp thu nhận và phương pháp thí nghiệm, thành phần
bromelain thân và quả khác nhau. Bromelain quả (ép từ quả) là protease acid
với điểm đẳng điện là 4,6; cấu tạo hơi khác so với loại enzyme trên.
Bromelain thân có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 321-144
acid amin và 283-161 đối với bromelain quả.
Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain  thân có acid amin
đầu  –NH2  là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả,
acid amin đầu –NH2 là alanine. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.4.3.2. Cấu trúc không gian
Cấu trúc bậc một của bromelain theo Murachi và Bussain:
Bromelain cũng như papain, ficin đều là các protease có tâm hoạt động
chứa cystein với cầu nối –S-S- (disulfur) giữa 2 sợi polypeptide với nhau.
Tâm hoạt động –Cys đặt cách nhóm imidazole của histidine là 5Ao
Chuỗi phân tử gấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu.
Bromelain có một nhóm sulfuhydryl cần cho hoạt tính xúc tác với 5 cầu
nối disulfid ở mỗi phân tử. Ngoài ra trong bromelain thân còn có sự hiện diện
của Zn2+ với hàm lượng 2 mg/gram enzyme có lẽ đóng vai trò duy trì cấu trúc
không gian của enzyme (Nguồn: Yasuda và ctv,1970).

2.4.4. Hoạt tính của bromelain
Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính bromelain kể từ 3 tháng trước khi chín. Trong
đó hoạt tính cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi  chín. Khi trái chín, hoạt tính
bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn.
Một số nghiên cứu cho thấy bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ
chất khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain
mạnh hơn papain gấp 4 lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai
enzyme này tương đương nhau. Đối với các cơ chất tổng hợp thì khả năng phân
giải của bromelain yếu hơn papain.
Bromelain  có 3 hoạt tính khác nhau:  peptidase,  amidase  và  esterase, hoạt
tính esterase ở bromelain hơn papain và ficin (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
.....
  TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1.  Phạm Thị Trân Châu, Phan Tiến Hoà và Nguyễn Thị Bảo, 1987. Thành phần và một
số tính chất của chế phẩm  bromelain  chồi ngọn Dứa tây (Ananas  comosus L.- Group
Queen). Tạp chí sinh học, 9(4), tr.3-9.  
2.  Dương Thị Hương Giang, 2004. Giáo trình thực tập công nghệ enzyme. Trường Đại
Học Cần Thơ.  
3.  Dương Thị Hương Giang, Lê Thanh Hùng, Võ Văn Song Toàn, Sonia Beeckmans,
Edilbert Van Driessche và Trần Phước Đường, 2002. Đánh giá các phương pháp ly trích
enzyme  bromelain  từ nước khóm thô. Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học,
Trường Đại Học Cần Thơ.  
4.  Phạm Thị Ánh Hồng, 2003.  Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia
TP.HCM.
5.  Nguyễn Văn Kế, 2001. Cây ăn quả nhiệt đới, tập 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp.
Hồ Chí Minh
6.  Nguyễn Đức Lượng, 2004.  Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia
TP.HCM.
7.  Lê Thị Thanh Mai, 1997.  Nghiên cứu về  bromelain  và con đường ứng dụng  của
chúng, luận án phó tiến sĩ sinh học. Trường đại học khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia
TP.HCM.
8.  Trần Văn Phú, 2001. Tính toán và thiết kế hệ thống sấy. Nhà xuất bản Giáo Dục.  
9.  Nguyễn Tiến Thắng, 2004. Giáo trình Công nghệ enzyme. Tủ sách trường Đại học
Nông Lâm TP.HCM.
10. Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học. Tủ sách Viện
Sinh Học Nhiệt Đới.
11. Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2000.  Kỹ thuật trồng dứa. Nhà xuất bản Nông
Nghiệp.

Tài liệu tiếng nước ngoài
12. Alfonso A.R., Roberto A.E. 1994.  Circular dichroism of stem  bromelain: a third
spectral class with the family of cysteine proteinases. Biochem. J. (1994) 300, 107-110.
13. Anthony J. and Cichoke D.C, 1998.  bromelain. Keats Publising, Inc. New Canaan,
Connecticut.
14. Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:  248-
254, 1976.
15. Chandler D.S and Mynott T.L, 1998. bromelain protects piglets from diarrhea caused
by oral challenge with K88 positive enterotoxigenic Escherichia Coli. Gut. 43 (2): 196-
202.
16. Clive Dennison,  A Guide to Protein Isolation. Kluwer Academic Publisher, New
York, 2002.
17. Collins J.L. 1960. The pineapple. New York: Interscience
18. Hames, P.D.,1998. Gel electrophoresis of proteins. Apractical approad. 3thed. Oxford
19. Liang H. H., Huang H. H., Kwok K. C, 1999. Properties of tea-polyphenol-complexed
bromelain. Food Research International 32, pp. 545-551.
20. Morton, J. F., Pineapple in: Major Medicinal Plants: “Botany, Culture and Uses”
21. Murachi, T., 1970. Method enzymol. 19, 273-284.  
22. Nielsen P. M., Petersen D., Dambmanm C, 2001.  Improved Method forDetermining
Food Protein Degree of Hyrolysis. Journal of food science, Vol. 66, No. 2, pp. 642-646
23. Rajni, H.K.  The workshop 2005 “ Enzyme Technology and Biosensors”.  Hanoi,
03/2005.
24.  Salem F. M. A., Somaya M. A. A., Seliem E. I, 1995. Manufacturing of fish sauce by
proteolytic enzymes. Department of food technology in national research centre, Dokki,
Cairo, Egypt.
25.  Stein Ivar Aspmo, Svein Jarie Horn, Vincent G. H. Eijsink, 2004.  Enzymatic
hydrolysis of Atlantic cod (Gadus morhua L.) viscera. Process Biochemistry.  

 MỤC LỤC
Nội dung  Trang
LỜI CẢM ƠN  .....................................................................................................................  iii
TÓM TẮT  ........................................................................................................................... iv
SUMMARY..........................................................................................................................v
MỤC LỤC  .......................................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG .................................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ  ............................................................................. xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề  .................................................................................................................................  1
1.2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................................................  2
1.3. Mục đích  ...................................................................................................................................  2
1.4. Giới hạn của đề tài  ....................................................................................................................  2
1.5. Nội dung thực hiện  ...................................................................................................................  2
PHẦN 2.  TỔNG QUAN TÀI LIỆU  ....................................................................................3
2.1. Giới thiệu sơ lược về cây dứa  ...................................................................................................  3
2.2. Giới thiệu về enzyme................................................................................................................  5
2.2.1.  Sơ lược về enzyme ............................................................................................................  5
2.2.1.1. Định nghĩa về enzyme  ..................................................................................................  5
2.2.1.2. Phân loại enzyme .........................................................................................................  5
2.2.1.3. Sự khác nhau về chất lượng enzyme và thị trường enzyme công nghiệp  ....................  7
2.2.2.  Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme.  ......................................................  8
2.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme  ..................................................................................  8
2.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất...................................................................................  8
2.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ  ...............................................................................................  8
2.2.2.4. Ảnh hưởng của pH  .......................................................................................................  9
2.3. Enzyme Protease ......................................................................................................................  9
2.3.1.  Giới thiệu sơ lược các enzyme protease  ..........................................................................  10
2.3.1.1. Protease vi sinh vật  .....................................................................................................  10
2.3.1.2. Protease động vật .......................................................................................................  10
2.3.1.3. Protease thực vật ........................................................................................................  10 
2.3.2.  Ứng dụng của enzyme protease.  ......................................................................................  10
2.4. Enzyme bromelain thu nhận từ dứa........................................................................................  11
2.4.1.  Giới thiệu Enzyme bromelain..........................................................................................  11
2.4.2.  Tính chất vật lí  .................................................................................................................  11
2.4.3.  Tính chất hóa học ............................................................................................................  12
2.4.3.1. Cấu tạo hóa học  ..........................................................................................................  12
2.4.3.2. Cấu trúc không gian  ...................................................................................................  13
2.4.4.  Hoạt tính của bromelain ..................................................................................................  13
2.4.4.1. Cơ chế tác động  ..........................................................................................................  14
2.4.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính  ...........................................................................  14
2.4.4.3. Các chất bảo vệ enzyme  .............................................................................................  16
2.4.5.  Ứng dụng của bromelain  .................................................................................................  17
2.4.6.  Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme Protease (chủ yếu là enzyme
bromelain)  ...................................................................................................................................  17
2.4.6.1. Nghiên cứu trong nước  ...............................................................................................  17
2.4.6.2. Nghiên cứu ngoài nước  ..............................................................................................  18
2.5. Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein/enzyme  ..............................................  19
2.5.1.  Chuẩn bị dịch protein thô  ................................................................................................  19
2.5.2.  Ổn định protein trong dịch chiết thô. ..............................................................................  19
2.5.3.  Các phương pháp tủa protein.  ..........................................................................................  20
2.5.3.1. Tủa bằng muối Sulfate ở các nồng độ khác nhau. .....................................................  20
2.5.3.2. Tủa bằng dung môi hữu cơ.........................................................................................  20
2.5.3.3. Tủa bằng điểm đẳng điện  ...........................................................................................  21
2.5.3.4. Tủa bằng các loại polymer  .........................................................................................  21
2.5.3.5. Tủa bằng chất đa điện phân  ........................................................................................  21
2.6. Tinh sạch protein  ....................................................................................................................  21
2.6.1.  Tại sao cần tinh sạch enzyme? ........................................................................................  21
2.6.2.  Mục tiêu và chiến lược tinh sạch enzyme .......................................................................  22
2.6.2.1. Mục tiêu .....................................................................................................................  22
2.6.2.2. Chiến lược tinh sạch enzyme .....................................................................................  22
2.6.3.  Giới thiệu các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch enzyme  ..........................  23
2.6.4.  Sự lựa chọn phương pháp tinh sạch protein  ....................................................................  23
2.7. Giới thiệu phương pháp sắc ký sinh Học  ...............................................................................  24
2.7.1.  Các kỹ thuật sắc ký sinh học cơ bản  ................................................................................  25 
2.7.2.  Sắc ký trao đổi ion  ...........................................................................................................  25
2.7.2.1. Khái niệm  ...................................................................................................................  25
2.7.2.2. Chọn chất trao đổi ion  ................................................................................................  27
2.7.2.3. Chọn dung dịch đệm ..................................................................................................  29
2.7.2.4. Phương pháp rửa thôi protein  .....................................................................................  29
2.8. Phương pháp đông khô sản phẩm (Freeze-drying) ................................................................  30
2.8.1.  Khái niệm ........................................................................................................................  30
2.8.2.  Các giai đoạn của quá trình đông khô  .............................................................................  30
2.8.3.  Máy đông khô được sử dụng trong nghiên cứu  ...............................................................  32
2.8.4.  Ứng dụng của phương pháp đông khô ............................................................................  32
2.9. Phương pháp điện di trên Gel SDS-PAGE (Hames, 1998)  ....................................................  32
2.9.1.  Giới thiệu  .........................................................................................................................  32
2.9.2.  Cấu tạo của gel Polyacrylamide  ......................................................................................  33
2.9.3.  Nguyên tắc hoạt động của SDS-PAGE  ...........................................................................  34
PHẦN 3.  VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  ...........................................35
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành  .............................................................................................  35
3.1.1.  Thời gian .........................................................................................................................  35
3.1.2.  Địa điểm ..........................................................................................................................  35
3.2. Vật liệu  ...................................................................................................................................  35
3.2.1.  Thân dứa  ..........................................................................................................................  35
3.2.2.  Hóa chất  ...........................................................................................................................  35
3.2.3.  Dụng cụ và thiết bị. .........................................................................................................  35
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...................................................................................  36
3.3.1.  Nội dung  ..........................................................................................................................  36
3.3.1.1. Cách lấy mẫu  ..............................................................................................................  36
3.3.1.2. Các bước chính để thu nhận enzyme bromelain từ dứa  .............................................  36
3.3.1.3. Xác định hoạt tính và protein tổng số ........................................................................  36
3.3.1.4. Điện di SDS-PAGE xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của enzyme.  ......  36
3.3.2.  Phương pháp thí nghiệm..................................................................................................  37
3.3.2.1. Thí nghiệm ly trích và khảo sát các tác nhân kết tủa .................................................  37
a. Thí nghiệm ly trích enzyme bromelain từ thân dứa ở quy mô nhỏ  ..................................  37
b. Thí nghiệm khảo sát các tác nhân kết tủa  ........................................................................  37
3.3.2.2. Thí nghiệm xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme  ...............................................  38 
a. Định lượng protein theo phương pháp Bradford (1976)  ..................................................  38
b. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson  ....................................................  39
3.3.2.3. Thí nghiệm tinh sạch enzyme bromelain bằng sắc ký trao đổi ion  ............................  42
a. Nguyên tắc .......................................................................................................................  42
b. Các bước tiến hành thí nghiệm ........................................................................................  42
3.3.2.4. Thí nghiệm điện di enzyme bromelain sau tinh sạch  .................................................  44
PHẦN 4.  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  ...........................................................................47
4.1. Khảo sát các tác nhân tủa  .......................................................................................................  47
4.1.1.  Kết quả xây đường chuẩn albumin theo phương pháp Bradford ....................................  47
4.1.2.  Kết quả xây dựng đường chuẩn tyrosine theo phương pháp Anson ...............................  48
4.1.3.  Kết quả xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme của dịch thô .........................  48
4.1.4.  Kết quả xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme của dịch tủa  ..........................  49
4.1.4.1. Tủa với tác nhân amonium sulfate  .............................................................................  49
4.1.4.2. Tủa với tác nhân acetone  ............................................................................................  50
4.1.4.3. Hiệu suất thu nhận enzyme bromelain thân bằng tác nhân tủa amonium sulfate và
acetone ở 4oC  ...........................................................................................................................  51
4.2. Kết quả tinh sạch enzyme bromelain bằng hệ thống tinh sạch BioLogic DuoFlow.  .............  54
4.2.1.  Kết quả thiết lập qui trình các bước cho máy BioLogic DuoFlow thực hiện.  .................  54
4.2.2.  Kết quả của quá trình tinh sạch .......................................................................................  60
a. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước tinh sạch .............................................  60
b. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain sau tinh sạch ................................................  61
c. Hiệu suất tinh sạch qua các giai đoạn ..............................................................................  61
4.3. Đông khô sản phẩm  ................................................................................................................  62
4.3.1.  Kết quả đo hàm lượng protein enzyme sau đông khô 2 tuần; 4 tuần.  .............................  63
4.3.2.  Kết quả hoạt tính enzyme sau đông khô 2 tuần; 4 tuần  ...................................................  63
4.4. Kết quả điện di xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch  ...............................................  64
PHẦN 5.  KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................................68
5.1. Kết luận ..................................................................................................................................  68
5.2. Đề nghị  ...................................................................................................................................  69

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................70
 
Đánh giá : 
5

Facebook Comments Box

X
Hãy điền tên đăng nhập ở Nông nghiệp hữu cơ của bạn.
Điền mật khẩu đi kèm với tên đăng nhập.
Đang nạp